Bakterie obecne w próbce metodą seryjnego rozcieńczania agaru lub metody całkowitej liczby płytek (TPC)

Całkowita liczba płytek (TPC):

W celu wyliczenia bakterii obecnych w próbce metodą seryjnego rozcieńczania agaru lub całkowitej liczby płytek (TPC).

Cel, powód:

Stopień aktywności bakterii w danej próbce w określonym zestawie warunków zależy głównie od całkowitej liczby bakterii w niej obecnych, niezależnie od ich gatunku.

Dlatego bardzo często konieczne jest ustalenie całkowitej liczby bakterii obecnych w próbkach żywności, wody, gleby, powietrza i tkanki podczas ich analizy mikrobiologicznej. Ta całkowita liczba bakterii obejmuje zarówno żywe jak i martwe bakterie. " Martwe bakterie nie mogą rosnąć i rozmnażać się.

Tylko żywe bakterie (zdolne do życia bakterie) mogą rosnąć i rozmnażać się, powodując specyficzną aktywność bakterii. Dlatego bardzo często wymagane jest wyliczenie żywotnych komórek bakterii w różnych próbkach. Jednak większość metod wyliczania, takich jak bezpośrednia liczba mikroskopowa, elektroniczna liczba komórek, metody chemiczne i metoda spektrofotometryczna, uwzględnia zarówno żywe, jak i martwe komórki.

Metody te nie mogą rozróżniać pomiędzy żywymi i martwymi komórkami. Dlatego metoda seryjnego rozcieńczania-agaru, która wylicza tylko żywe komórki bakterii, jest powszechnie stosowaną metodą liczenia żywych żywotnych komórek w różnych próbkach.

Zasada:

Określoną masę stałej próbki homogenizuje się aseptycznie w dziewięciu objętościach sterylnej soli fizjologicznej, aby uzyskać jednorodną zawiesinę bakterii. Ciekła próbka jest bezpośrednio używana jako homogenna zawiesina bakterii. Zawiesiny tak otrzymanych bakterii są rozcieńczane seryjnie (10 razy, 100 razy, 1000 razy itp.). Tutaj 10-1, 10-2, 10-3 itd. Nazywane są rozcieńczeniami.

Ich odwrotności (10 1, 10 2, 10 3 itd.) Nazywane są współczynnikami rozcieńczenia. Określoną objętość zawiesiny bakterii z każdego rozcieńczenia zaszczepia się na płytkach agarowych i odpowiednio rozsiewa, aby rozdzielić poszczególne komórki bakterii i oddzielić je od siebie.

Inokulacja bakterii w celu jej wyliczenia odbywa się w dwóch następujących technikach:

1. Wlać technikę płytki

2. Rozciągnij technikę płytkową

1. Wlać technikę płytki:

W tej technice 1 ml zawiesiny bakterii upuszcza się na wysterylizowaną płytkę Petriego, a następnie wylewa się na nią skroplone medium agarowe. Szalka Petriego jest delikatnie wirowana, aby zawiesina mogła mieszać się z podłożem równomiernie. Dozwolone jest ochłodzenie i zestalenie.

2. Technika płyty rozporowej:

W tej technice 0, 1 ml zawiesiny bakterii upuszcza się na przygotowaną płytkę agarową. Następnie kropla zawiesiny rozprowadza się równomiernie na płytce agarowej za pomocą sterylizowanego rozpylacza szklanego.

Aby zminimalizować błąd, każdą rozcieńczoną zawiesinę wysiewa się na 2-5 powtórzonych płytkach. Zaszczepione płytki inkubuje się w 37 ° C przez 24 godziny. W tym czasie każda wyizolowana pojedyncza komórka bakterii na płytce agarowej rośnie i szybko się mnoży, aby wytworzyć makroskopową widzialną masę komórek bakterii zwanych "kolonią". Tak więc liczba kolonii na płytce reprezentuje liczbę bakterii w próbce.

Jednak bardzo często podczas rozsiewu niektóre komórki mogą nie zostać odpowiednio rozdzielone, a kilka takich nierozdzielonych komórek może wytworzyć pojedynczą kolonię. Ponadto niewiele komórek ma tendencję do pozostawania w parach, łańcuchach lub klastrach.

Tutaj każda para, łańcuch lub grupa tworzy kolonię. Zatem każda kolonia, w ścisłym znaczeniu, nie reprezentuje pojedynczej bakterii. Dlatego zamiast wyrażać liczbę bakterii jako "Nie. bakterii / gm lub ml próbki ", bardzo często wyrażana jest jako liczba jednostek tworzących kolonie na gm lub ml (CFU / gm lub ml).

Całkowitą liczbę płytek (TPC) w oryginalnej próbce oblicza się, mnożąc liczbę procesorów z odpowiednimi współczynnikami rozcieńczenia. "Zasady wyliczania" są przestrzegane, przy obliczaniu liczby bakterii w oryginalnej próbce.

Wymagane materiały:

Szalki Petriego (15 nos.), Pipety 2 ml (10 nos.), Pipeta 10 ml (1 liczba), probówki (10 nos.), Kolby stożkowe (500 ml i 1 litr - 1 szt. Każda), Zlewka 500 ml (2 nos.), Szklany rozsiewacz, koperta ze stali nierdzewnej, papier ścierny, nić (lub gumka), niechłonna bawełna, alkohol etylowy, chlorek sodu (NaCl), 0, 1 N kwas chlorowodorowy (HCl), 0, 1 N wodorotlenek sodu (NaOH), woda destylowana, agar odżywczy, próbka płynna (np. Woda w stawach / woda ściekowa), próbka stała (np. Gleba / mięso ryb / mięso ostryg / przetworzona żywność), papier pH (lub pH-metr), tłuczek i moździerz (lub homogenizator), palnik bunsena, piec z gorącym powietrzem, autoklaw, inkubator, komora laminarna, licznik kolonii Quebec.

Procedura:

1. Dziesięć pipet (w przypadku pipety ze stali nierdzewnej), 15 szalek Petriego i parę tłuczek i moździerz (lub jeden kubek do homogenizacji) sterylizuje się w piecu z gorącym powietrzem w temperaturze 180 ° C przez 3 godziny. Alternatywnie można je pokryć papierem ściernym, przewiązać nitką lub taśmą gumową i sterylizować w autoklawie wraz z medium (rysunek 6.6).

Liczbę płytek Petriego i odpowiednio ilość stosowanego medium oblicza się w zależności od liczby wymaganych powtórzeń i rozcieńczeń. W tym przypadku naczynia szklane i podłoże zostały pobrane do pojedynczej replikacji i rozcieńczenia do 10 -6 . Liczba szkła i ilość medium pobranego do sterylizacji jest nieco większa, aby uniknąć przypadkowego błędu, ponieważ sterylizacja jest długotrwałym procesem.

2. 4, 25 g NaCl rozpuszcza się w 500 ml wody destylowanej, otrzymując fizjologiczny roztwór soli (0, 85%). 225 ml tego roztworu soli wlano do 500 ml kolby stożkowej. Jego usta są pokryte bawełną, pokryte papierem ściernym i związane nicią lub gumką. Jest on stosowany jako pierwszy rozcieńczalnik do rozcieńczania stałej próbki.

3. Do każdej z 10 probówek pipetuje się również 9, 0 ml lewostronnej soli fizjologicznej. Ich usta są pokryte bawełną, pokryte papierem ściernym i związane nicią lub gumką. Są one używane jako rozcieńczalniki do rozcieńczania seryjnego.

4. Składniki odżywczego podłoża agarowego lub jego gotowego proszku wymagane dla 500 ml pożywki są ważone i rozpuszczane w 500 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 1 litra przez wstrząsanie i mieszanie.

Jego pH określa się przy użyciu papieru lub pH-metru pH i doprowadza się do 7, 0 za pomocą 0, 1N HCl, jeśli jest on większy lub stosuje 0, 1 N NaOH, jeśli jest on mniejszy. Kolbę ogrzewa się w celu całkowitego rozpuszczenia agaru w pożywce. Następnie jest bawełniana, pokryta papierem ściernym i przewiązana nicią lub gumką.

5. Kolbę stożkową o pojemności 500 ml zawierającą 225 ml roztworu soli fizjologicznej, 10 probówek zawierających 9 ml solanki i 1-litrową stożkową kolbę zawierającą 500 ml odżywczego podłoża agarowego sterylizuje się w temperaturze 121 ° C (ciśnienie 15 psi) przez 15 minut w autoklawie.

6. Po sterylizacji sterylizowane materiały są usuwane z autoklawu i pozostawione do ochłodzenia przez pewien czas, bez umożliwienia zestalenia się ośrodka. Chłodzenie medium zapobiega kondensacji i gromadzeniu się kropel wody wewnątrz płytek. Jeśli podłoże zostało już przygotowane i zestalone podczas przechowywania, musi zostać upłynnione przez ogrzewanie ostrożnie, aż całkowicie się rozpuści.

7. Aby przygotować płytki agarowe, zanim sterylizowany podłoże agarowe zostanie schłodzone i zestalone, w stanie ciepłego stopu, zostanie wylany aseptycznie na 6 sterylizowanych szalek Petriego (w przybliżeniu po 20 ml), tak aby stopione podłoże pokrywało dno szalki Petriego. potraw całkowicie.

Następnie płytki pokrywa się pokrywami i pozostawia do ochłodzenia, aby zestalić w nich medium. Para wodna, która może kondensować się na wewnętrznej powierzchni płytek i pokrywek, odparowuje się, utrzymując płytki i pokrywy w odwróconej pozycji w inkubatorze w temperaturze 37 ° C przez około 1 godzinę.

8. 25 g stałej próbki (np. Mięso ryb / mięso ostryg / przetworzona żywność) jest waga i homogenizowane w 225 ml sterylizowanej soli fizjologicznej (rozcieńczalnik) w warunkach aseptycznych (rysunek 6.7). Daje to 10-krotne rozcieńczenie (rozcieńczenie = 10 -1 ). W przypadku próbki ciekłej 1 ml próbki pipetuje się aseptycznie do 9 ml sterylizowanej soli fizjologicznej. Daje to również 10-krotne rozcieńczenie (rozcieńczenie = 10 -1 ).

9. 1 ml rozcieńczenia 10-1 przenosi się do 9 ml sterylizowanej soli fizjologicznej w innej probówce testowej. Daje to 100-krotne rozcieńczenie (rozcieńczenie = 10 -2 ). Z rozcieńczenia 10-2, 1 ml wkrapla się do wyjałowionej szalki Petriego i 0, 1 ml na płytkę z agarem z tej samej pipety. Do każdego rozcieńczenia używana jest osobna wysterylizowana pipeta. Po użyciu zanurza się w słoiku do przechowywania.

10. 1 ml rozcieńczenia 10-2 przenosi się do 9 ml sterylizowanej soli fizjologicznej w innej probówce testowej. Daje to 1000-krotne rozcieńczenie (rozcieńczenie = 10 -3 ). Z rozcieńczenia 10-3, 1 ml wkrapla się do wyjałowionej szalki Petriego i 0, 1 ml na płytkę z agarem z tej samej pipety. W podobny sposób rozcieńczanie kontynuuje się do 10 -6 seryjnie, za każdym razem przenosząc 1 ml do wyjałowionej płytki Petriego i 0, 1 ml do płytki agarowej z tej samej pipety.

11. Następnie kropelki zawiesiny na płytkach agarowych rozprowadza się w warunkach aseptycznych za pomocą sterylizowanego rozpylacza szklanego. Po rozprowadzeniu na każdej płytce można ją sterylizować płomieniowo przez zanurzenie w alkoholu i ukazanie płomienia. Jest to "technika rozsiewu płyt".

12. Płytki Petriego zawierające 1 ml zawiesiny bakterii są pobierane i sterylizowany skroplony agar odżywczy jest wlewany do nich. Są delikatnie wirowane, aby umożliwić jednorodne mieszanie zawiesiny z podłożem. Płytki pozostawia się do ostygnięcia aż do zestalenia się ośrodka. To jest technika "nalewania płytek".

13. Następnie płytki inkubuje się w odwróconej pozycji, z góry do dołu, w 37 ° C przez 24 godziny w inkubatorze (Figura 6.7).

14. Niewytworzoną płytkę z agarem inkubuje się jako kontrolę w celu zapewnienia właściwej sterylizacji, co pokazuje brak wzrostu na niej.

Obserwacje:

Liczbę kolonii bakterii na płytkach oblicza się bezpośrednio lub za pomocą licznika kolonii Quebec. Na tej podstawie oblicza się liczbę bakterii obecnych w gramach lub ml oryginalnej próbki. Nazywa się to wyliczeniem.

Zasady wyliczania:

1. Należy rozważyć szalki Petriego zawierające od 30 do 300 kolonii.

2. Średnia liczba duplikatów i potrójnych powtórzeń (R 1, R 2 R 3 ...) jest rozpatrywana tylko wtedy, gdy jedna liczba nie jest większa od dwukrotności drugiej. Jeśli jeden jest więcej niż podwójny od drugiej, przyjmuje się niższą wartość.

3. W technice nalewania płytki liczba bakterii wynosi X X 10 c / g, gdzie c = współczynnik rozcieńczenia. W technice rozsiewu płytkowego liczba bakterii wynosi X10 c + 1 / g, gdzie c = współczynnik rozcieńczenia. Liczba jest konwertowana do dwóch miejsc po przecinku w postaci (x.yz X 10 m ). Na przykład 288 X 10 4 jest wyrażone jako 2, 88 X 10 6 .

4. Jeśli we wszystkich rozcieńczeniach liczba kolonii jest większa niż 300, należy liczyć się z najwyższym rozcieńczeniem i jeśli we wszystkich rozcieńczeniach jest mniejsza niż 30, należy wziąć pod uwagę najniższe rozcieńczenie. W obu przypadkach liczba jest reprezentowana jako: szacowana liczba X 10 c / gm lub ml dla techniki nalewania i szacowana wartość X 10 c + 1 / gm lub ml dla techniki nakładania płytek.

5. Jeśli w żadnym rozcieńczeniu nie zaobserwowano żadnej kolonii, jest ona reprezentowana jako: Szacowana <1 x najniższe rozcieńczenie.

6. Ponieważ seryjne rozcieńczenie ma miejsce 10 razy, matematycznie oczywiste jest, że żadne dwa rozcieńczenia nie mogą zawierać kolonii między 30 a 300. Na przykład, jeśli 10 -3 ma 50 kolonii, 10 -2 powinno mieć 500 (tj. 300), a 10 -4 powinno mieć 5 (tj. <30) kolonii.

Jednak nie dzieje się tak w rzeczywistości, ponieważ bakterie nie występują jako jednorodne rozwiązanie; raczej występują jako zawiesina w rozcieńczalnikach. Jeśli istnieją dwa rozcieńczenia mające policzalne kolonie (między 30 a 300), najpierw obliczyć liczbę jednostek tworzących kolonie / gm lub ml przy użyciu każdego rozcieńczenia.

Jeśli jedna wartość jest większa niż podwójna, zgłoś niższą wartość. Jeśli nie, weź średnią z dwóch wartości i zgłoś tę wartość.