Hodowla bakterii z próbek stałych, płynnych i wymazowych (z rysunkiem)

Cel, powód:

Główne cele uprawy bakterii są następujące:

1. Zwiększenie liczby bakterii, aby uzyskać je w widocznych postaciach, jako kolonie lub zawiesiny.

2. Izolacja bakterii.

3. Utrzymanie czystej kultury wyjściowej i standardowych hodowli.

4. Oznaczanie bakterii w próbkach.

5. Wykrywanie poszczególnych bakterii będących przedmiotem zainteresowania w próbce i jej wyliczanie.

6. Identyfikacja bakterii na podstawie charakterystyki kolonii, charakterystyki wzrostu na skosach i aktywności biochemicznej w różnych mediach.

Jednak celem tego eksperymentu jest jedynie hodowanie bakterii z próbek płynnych, stałych i powierzchniowych w stałych i ciekłych mediach, tak aby uzyskać je w widocznych postaciach odpowiednio jako kolonie lub zawiesina.

Zasada:

Bakterie hoduje się w wysterylizowanych, bogatych w pokarm płynach lub pożywkach stałych. Ciekłe pożywki, zwane bulionem, znajdują się w probówkach z utworzeniem "bulionu bulionowego", podczas gdy media stałe, zwane pożywką agarową, są zawarte w szalkach Petriego, tworząc "płytki agarowe" lub po prostu "płytki". Uprawa bakterii wymaga materiału, który prawdopodobnie zawiera bakterie.

Większość rzeczy, które widzimy, zawiera bakterie. Występują w zębach, żywności, glebie, wodzie, fekaliach, a nawet w samych niesterylnych podłożach mikrobiologicznych. Określoną ilość jednorodnej zawiesiny któregokolwiek z materiału zawierającego bakterie inokuluje się do sterylizowanych pożywek aseptycznie i inkubuje w inkubatorze w 37 ° C przez 24 godziny.

W płynnym bulionie bakterie rosną w postaci zawiesiny i powodują jej mętnienie. Na stałych płytkach agarowych rosną one jako kolonie; każda kolonia wyrastająca z pojedynczej bakterii. Hodowlę bakterii przeprowadza się w następujących pięciu etapach.

1. Przygotowanie mediów

2. Sterylizacja mediów i wyrobów szklanych

3. Inokulacja

4. Inkubacja

5. Obserwacja

1. Przygotowanie mediów:

Zazwyczaj w przygotowaniu płynnego bulionu i półstałych pożywek składniki waży się w określonych proporcjach i rozpuszcza w wymaganej ilości wody. Obecnie dostępne są gotowe proszki zawierające składniki w wymaganych proporcjach.

W przygotowaniu płynnych podłoży bulionowych określoną ilość proszku (jak podano na etykiecie opakowania) odważa się i rozpuszcza w wymaganej ilości wody w kolbie stożkowej. Składniki rozpuszcza się przez ogrzewanie, wylewa do probówek i sterylizuje w autoklawie.

Jednak przy przygotowywaniu pełnych płytek, skosów i głębokich rurek, określoną ilość proszku (jak podano na etykiecie opakowania) odważa się i rozpuszcza w wymaganej ilości wody w kolbie stożkowej. Tak przygotowaną pożywkę sterylizuje się najpierw w autoklawie i następnie pozostawia do ostygnięcia przez pewien czas.

Gdy jest jeszcze ciepły, zanim się zestali, zostanie wylany na wysterylizowane szalki Petriego lub probówki i pozostawiony do zestalenia po schłodzeniu do temperatury pokojowej. Media w bardzo gorącym stanie nigdy nie powinny być wylewane do pojemników, ponieważ prowadzi to do kondensacji wody na ściankach pojemników, które spadają na powierzchnię mediów i mogą prowadzić do jej zanieczyszczenia.

2. Sterylizacja:

Szkło jest sterylizowane w piecu z gorącym powietrzem w temperaturze 180 ° C przez 3 godziny, a medium w autoklawie w temperaturze 121 ° C (ciśnienie 15 psi) przez 15 minut. Szkliwo można również sterylizować w autoklawie, ale nie należy nigdy sterylizować mediów w piecu, ponieważ woda ucieka z mediów i ulega odwodnieniu.

3. Inokulacja:

Przyjmuje się, że próbki cieczy są homogenicznymi zawiesinami bakterii. Dlatego do hodowli w bulionie, określoną objętość próbki pipetuje się aseptycznie do bulionu. Do hodowli na płytkach agarowych określoną objętość próbki pipetuje się na stałą płytkę agarową i rozprowadza się na powierzchni ośrodka aseptycznie.

W przypadku próbek stałych próbkę o określonej masie homogenizuje się w warunkach aseptycznych w określonej objętości normalnego roztworu fizjologicznego soli fizjologicznej (0, 85% chlorku sodu) przy użyciu sterylizowanego tłuczka i moździerza lub blendera. Większość ludzkich patogenów jest izotonicznych dla ludzkiego ciała (0, 85% chlorku sodu).

Zwykle stosunek próbki do soli wynosi 1: 9 (1 g + 9 ml, 10 g + 90 ml, 25 g + 225 ml lub 50 g + 450 ml). Określoną objętość tej homogenizowanej cieczy, która jest uważana za homogenną zawiesinę bakterii, pipetuje się aseptycznie do wysterylizowanego bulionu w probówkach do hodowli bulionowej. W celu hodowli na płytkach agarowych ciekłą zawiesinę pipetuje się na powierzchnię płytek i rozlewa aseptycznie.

W przypadku próbek powierzchni pobranych do badania mikrobiologii powierzchni stałych (blaty stołów, powierzchni ciała lub rany) powierzchnię należy przetrzeć sterylizowanym wacikiem. Wacik jest dotykany na powierzchni wysterylizowanej płytki agarowej. Z punktu widzenia dotyku smugi są sterylizowane w pętli aseptycznie, aby wyizolować bakterie.

4. Inkubacja:

Zaszczepione buliony i płytki bulionowe inkubuje się w temperaturze 37 ° C przez 24 godziny w inkubatorze.

5. Obserwacja:

Mętność w płynnym bulionie i kolonie na płytkach agarowych wskazują na wzrost bakterii.

Wymagane materiały:

Szalki Petriego (6 nos.), 2 ml pipety (5 nos.), Probówki (5 nos.), Kolby stożkowe (100 ml, 250 ml i 500 ml-l każda), zlewka 250 ml (2 nos.), Szkło rozrzutnik, koperta ze stali nierdzewnej, papier ścierny, nić (lub taśma gumowa), niechłonna bawełna, małe sztyfty, pętelka, alkohol etylowy, chlorek sodu (NaCl), 0, 1N kwas chlorowodorowy (HC1), 0, 1 N wodorotlenek sodu (NaOH ), woda destylowana, bulion odżywczy, agar odżywczy, próbka płynna (np. woda w stawie), próbka stała (np. gleba), próbka powierzchni (np. blat stołu, powierzchnia ciała, rana), papier pH (lub pH-metr), tłuczek i moździerz (lub homogenizator), palnik bunsena, piec z gorącym powietrzem, autoklaw, inkubator, komora laminarna.

Procedura:

1. Pięć pipet (w przypadku pipety ze stali nierdzewnej), sześć płytek Petriego i parę tłuczek i moździerz (lub jeden kubek do homogenizacji) sterylizuje się w temperaturze 180 ° C przez 3 godziny w piecu z gorącym powietrzem. Ewentualnie można je pokryć papierem ściernym, przewiązać nitką lub gumką i wysterylizować w autoklawie wraz z nośnikiem (rysunek 6.1).

2. 0, 85 g NaCl rozpuszcza się w 100 ml wody destylowanej w 250 ml zlewce i 90 ml tego roztworu soli wlewa się do kolby stożkowej o pojemności 100 ml. Usta są pokryte bawełną, pokryte papierem ściernym i związane nicią lub gumką.

3. Składniki odżywczej pożywki bulionowej wymagane dla 100 ml bulionu są ważone. Alternatywnie, odważa się określoną ilość gotowego bulionu odżywczego w proszku (mieszaninę składników).

4. Składniki (lub gotowego proszku) rozpuszcza się w 100 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml, wstrząsając i wirując. Jego pH określa się przy użyciu papieru do pomiaru pH lub pH-metru. Wartość pH doprowadza się do 7, 0, stosując 0, 1 N HCl, jeśli jest ona większa lub stosuje 0, 1 N NaOH, jeśli jest mniejsza. Kolbę ogrzewa się, jeśli jest to wymagane, w celu całkowitego rozpuszczenia składników.

5. Bulion rozdziela się na 5 probówek (w przybliżeniu po 10 ml), ich usta są zatkane bawełną, przykryte papierem ściernym i związane nicią lub gumką.

6. Składniki odżywczego podłoża agarowego lub jego gotowego proszku wymagane dla 200 ml pożywki są ważone i rozpuszczane w 200 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 500 ml poprzez wstrząsanie i mieszanie.

Jego pH określa się przy użyciu papieru lub pH-metru pH i doprowadza się do 7, 0 za pomocą 0, 1N HCl, jeśli jest on większy lub stosuje 0, 1 N NaOH, jeśli jest on mniejszy. Kolbę ogrzewa się w celu całkowitego rozpuszczenia agaru w pożywce. Następnie jest bawełniana, pokryta papierem ściernym i przewiązana nicią lub gumką.

7. Waciki są wytwarzane przez skręcenie bawełny wokół końców małych pałeczek. Kilka takich wacików trzyma się w probówce z bawełnianymi końcówkami skierowanymi w dół. Probówka jest bawełniana, pokryta papierem ściernym i przewiązana nicią lub gumką.

8. Kolbę stożkową o pojemności 100 ml z 90 ml roztworu soli fizjologicznej, 5 probówek z pożywką, kolbę stożkową o pojemności 500 ml zawierającą pożywkę agarową o objętości 200 ml i probówkę zawierającą gaziki sterylizuje się w temperaturze 121 ° C (ciśnienie 15 psi) dla 15 minut w autoklawie.

9. Po sterylizacji sterylizowane materiały są usuwane z autoklawu i pozostawione do ochłodzenia przez jakiś czas, bez umożliwienia zestalenia się ośrodka. Chłodzenie medium zapobiega kondensacji i gromadzeniu się kropel wody wewnątrz płytek. Jeśli podłoże zostało już przygotowane i zestalone podczas przechowywania, musi zostać upłynnione przez ogrzewanie ostrożnie, aż całkowicie się rozpuści.

10. Aby przygotować odżywcze płytki agarowe, przed sterylizowanym podłoem agarowym pożywki schłodzi się i zestala, w ciepłym stanie stopionym, wylewa się aseptycznie na 6 sterylizowanych szalek Petriego (w przybliżeniu po 20 ml), tak aby stopione podłoże pokrywało dno szalki Petriego całkowicie.

Następnie płytki pokrywa się pokrywami i pozostawia do ochłodzenia, aby zestalić w nich medium. Para wodna, która może kondensować się na wewnętrznej powierzchni płytek i pokrywek, odparowuje się, utrzymując płytki i pokrywy w odwróconej pozycji w inkubatorze w temperaturze 37 ° C przez około 1 godzinę.

11. Pobrano ciekłą próbkę (prawdopodobnie zawierającą bakterie, np. Wodę w stawie). Jeden ml każdej próbki aseptycznie jest pipetowany do 2 bulionów (rysunek 6.2). Rury są zawirowane. Ciekłą próbkę pipetuje się również aseptycznie na 2 płytki agarowe po 0, 1 ml i rozprowadza na powierzchni pożywki agarowej za pomocą sterylizowanego na płomieniach szklanego rozsiewacza.

Przed każdym rozkładaniem przez szklany rozsiewacz jest zanurzany w alkoholu i palony nad palnikiem bunsenowym. Zaszczepione buliony i płytki bulionowe inkubuje się w temperaturze 37 ° C przez 24 godziny w inkubatorze. Płytki inkubuje się w pozycji odwróconej, z góry do dołu.

12. W przypadku próbki stałej (np. Gleby), 10 g próbki aseptycznie ważono i homogenizowano w sterylizowanym moździerzu i moździerzu lub naczyniu homogenizacyjnym po dodaniu 90 ml sterylizowanej soli fizjologicznej z kolby stożkowej o pojemności 100 ml.

Tę jednorodną zawiesinę bakteryjną aseptycznie pipetowano do 2 bulionowych probówek i 2 płytek agarowych jak w etapie 11 i inkubowano w 37 ° C przez 24 godziny w inkubatorze (Figura 6.2). Płytki inkubuje się w pozycji odwróconej, z góry do dołu.

13. W przypadku pobierania próbek powierzchni podejrzewany o obecność bakterii (blat stołu, powierzchnia ciała, rana) jest oznaczony jako obszar jednostkowy (np. 1 cm ² ), który jest wcierany przez wysterylizowany wacik. Wymaz dotyka się powierzchni dwóch pozostawionych płytek agarowych.

Smużenie odbywa się w warunkach aseptycznych za pomocą sterylizowanej płomieniowo pętli. W przypadku smug rysuje się prawie równoległe linie za pomocą pętli z punktu kontaktu z wacikiem. Tworzą pierwotne smugi. Po sterylizacji płomieniem pętli, wtórne smugi są rysowane prawie po przekątnej do pierwotnych pasów. W podobny sposób, trzeciorzędowe i czwartorzędowe smugi są wytwarzane w warunkach aseptycznych.

14. Następnie płytki inkubuje się w odwróconej pozycji, z góry do dołu, w 37 ° C przez 24 godziny w inkubatorze (Figura 6.2).

15. Jedna niezaszczepiona płytka agarowa i jedna niezaszczepiona bulionowa bulion są inkubowane jako kontrola w celu zapewnienia właściwej sterylizacji, jak wskazuje brak wzrostu w nich. Ten krok jest opcjonalny.

Obserwacje (charakterystyka kulturalna):

Kultura bulionowa:

(i) Obserwowana mętność:

Wzrost miał miejsce. Obserwuje się charakterystykę wzrostu w następujący sposób (rysunek 6.3).

(za) Jednolita delikatna zmętnienie: drobno rozproszony wzrost w całym tekście.

(b) Flokulant: kruszywo łamliwe rozproszone w całym tekście.

(do) Pellicle: Gruby wzrost podobny do pada na powierzchni.

(re) Osad: Stężenie wzrostu na dnie kultury bulionowej; może być ziarnisty, łuszczący się lub flokulant.

(ii) Bez mętności:

Nie nastąpił wzrost. Stosowana próbka nie zawiera bakterii.

2. Spread Plate Culture:

(i) Obserwowano kolonie:

Wzrost miał miejsce. Obserwuje się charakterystykę kolonii w następujący sposób (rysunek 6.3).

1. Rozmiar: Punktowy, mały, średni lub duży.

2. Pigmentacja: Kolor kolonii.

3. Forma: Kształt kolonii opisany jest w następujący sposób:

(za) Okólnik: nieprzerwana krawędź urządzenia peryferyjnego.

(b) Nieregularne: Ząbkowana krawędź obwodu.

(do) Rhizoid: Rootopodobny wzrost rozprzestrzeniający się.

4. Margines:

Wygląd zewnętrznej krawędzi kolonii jest opisany w następujący sposób:

(za) Cała: ostro zdefiniowana, parzysta.

(b) Lobate: zaznaczone wcięcia.

(do) Undulate: Faliste wgniecenia.

(re) Serrate: Wygląd podobny do zęba.

(e) Filamentowe: krawędź rozdzielająca w kształcie nici.

5. Elewacja:

Stopień, w jakim podnosi się kolonię, jest opisany w następujący sposób:

(a) Mieszkanie: nie widać rozstawu.

(b) Podniesiony: Nieznacznie podniesiony.

(c) Wypukły: Wzniesienie w kształcie kopuły.

(d) Umbonat: Podniesiony z wypukłym środkowym obszarem.

(ii) Bez kolonii:

Na talerzu nie było wzrostu. Stosowana próbka nie zawiera bakterii.

3. Kultura płytki smugowej:

(i) Obserwowano kolonie:

Wzrost miał miejsce. Obserwuje się charakterystyki kolonii, jak opisano powyżej.

(ii) Bez kolonii:

Nie nastąpił wzrost: użyta próbka powierzchniowa jest wolna od bakterii.