Test deoksyrybonukleazy na bakteriach, aby dowiedzieć się ich zdolności do hydrolizy DNA (z rysunkiem)

Test deoksyrybonukleazy (test DNazy) na bakteriach, aby dowiedzieć się, jakie są ich zdolności do hydrolizy DNA (z rysunkiem)!

Zasada:

Niektóre bakterie mają zdolność hydrolizowania kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) do oligonukleotydów, ponieważ mogą wytwarzać zewnątrzkomórkowy enzym hydrolizujący "dezoksyrybonukleazę" (DNazę).

Podczas gdy DNA ulega strąceniu przez nieprzezroczystość wytwarzania kwasu chlorowodorowego, jego hydrolizowane produkty końcowe, oligonukleotydy, nie ulegają strącaniu kwasem solnym, w przypadku którego nie powodują takiej nieprzezroczystości; raczej zapewniają przejrzystość.

W teście DNazy badane bakterie hoduje się na płytkach agarowych zawierających DNA. Po zauważeniu kolonii bakterii, płytki są zalewane kwasem chlorowodorowym. Jeśli bakterie mają zdolność hydrolizowania DNA, jego kolonie hydrolizują DNA w podłożu w otaczających je obszarach, podczas gdy pozostałe obszary płytek zawierają niehydrolizowane DNA.

W rezultacie, gdy są zalewane kwasem chlorowodorowym, wokół kolonii powstają przezroczyste strefy przezroczyste, ponieważ powstałe wokół nich produkty hydrolizowane, oligonukleotydy nie tworzą osadu z kwasem solnym.

Z drugiej strony, pozostałe obszary płytek stają się nieprzezroczyste, ponieważ niehydrolizowany DNA w tych obszarach tworzy osad z kwasem chlorowodorowym. Jeśli zamiast kwasu solnego stosuje się błękit toluidynowy, halo różoworóżowe wytwarza się tylko wokół kolonii.

Wymagane materiały:

Szalki Petriego, kolby stożkowe, kołpaki bawełniane, pętelka do inokulacji, autoklaw, palnik bunsena, komora laminarna, słoik utylizacyjny, inkubator, agar DNase, IN kwas chlorowodorowy (lub 0, 1% błękit toluidyny), wyizolowane kolonie lub czyste kultury bakterii.

Procedura:

1. Dwie szalki Petriego są czyszczone, przykrywane papierem ściernym i wiązane nicią lub gumką (rysunek 7.23). Ten krok, jak również sterylizacja szalek Petriego w etapie 6, pomija się, jeśli stosuje się bezpośrednio sterylizowane w piecu szalki Petriego.

2. Składniki pożywki agarowej DNase (zawierającej DNA jako główny składnik) lub jej gotowy proszek wymagany dla 100 ml pożywki waży się i rozpuszcza w 100 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml, wstrząsając i wirując.

3. Wartość pH ustala się za pomocą papieru lub pH-metru pH i doprowadza się do 7, 2 za pomocą 0, 1N HCl, jeśli jest on większy lub stosuje 0, 1 N NaOH, jeśli jest on mniejszy.

4. Kolbę ogrzewa się w celu całkowitego rozpuszczenia agaru w podłożu.

5. Kolba jest bawełniana, pokryta papierem ściernym i przewiązana nicią lub gumką.

6. Dwie szalki Petriego i kolbę stożkową zawierającą pożywkę agarową DNase sterylizowano w 121 ° C (ciśnienie 15 psi) przez 15 minut w autoklawie.

7. Po sterylizacji są one usuwane z autoklawu i pozostawione do ochłodzenia przez pewien czas, nie dopuszczając do zestalenia się ośrodka. Chłodzenie medium zapobiega kondensacji i gromadzeniu się kropel wody wewnątrz płytek. Jeśli podłoże zostało już przygotowane i zestalone podczas przechowywania, musi zostać upłynnione przez ogrzewanie ostrożnie, aż całkowicie się rozpuści.

8. Aby przygotować agarowe płytki DNase przed sterylizowanym medium agarowym DNase, które się ochładza i zestala, w stanie ciepłym stopionym, jest nalewany aseptycznie, najlepiej w komorze laminarnej, do dwóch wysterylizowanych szalek Petriego (w przybliżeniu po 20 ml), tak aby stopione medium całkowicie pokrywa dno szalek Petriego.

Następnie płytki pokrywa się pokrywami i pozostawia do ochłodzenia, aby zestalić w nich medium. Para wodna, która może kondensować się na wewnętrznej powierzchni płytek i pokrywek, odparowuje się, utrzymując płytki i pokrywy w odwróconej pozycji w inkubatorze w temperaturze 37 ° C przez około 1 godzinę.

9. Każda płyta jest oznaczona na dolnej stronie na cztery kwadraty.

10. "Miejsce inokulacji" badanych bakterii odbywa się w warunkach aseptycznych, najlepiej w komorze laminarnej, pośrodku każdej ćwiartki, wykonując plamkę (lub niewielką rozmaz) bakterii za pomocą sterylizowanej płomieniowo pętli. Pętla jest sterylizowana po każdej inokulacji.

11. Zaszczepione płytki inkubuje się w pozycji odwróconej, z góry do dołu, w temperaturze 37 ° C przez 24 do 48 godzin w inkubatorze, aż do pojawienia się kolonii bakterii.

12. Płytki zalewano roztworem 1 N kwasu chlorowodorowego (lub 0, 1% błękitu toluidynowego).