W Dole Test, aby sprawdzić zdolność bakterii do hydrolizowania tryptofanu aminokwasowego (z rysunkiem)

W Dole Test, aby sprawdzić zdolność bakterii do hydrolizowania tryptofanu aminokwasowego!

Zasada:

Niektóre bakterie mają zdolność hydrolizowania aminokwasu tryptofanu do indolu, ponieważ mogą wytworzyć enzym "tryptofanazę".

Tryptofan jest hydrolizowany z wytwarzaniem indolu, kwasu pirogronowego i amoniaku. Indol jest wykrywany przez barwny odczynnik, paradimetyloaminobenzaldehyd (p-DMAB, tj. Odczynnik Kovaca), który wytwarza różowy pierścień. Indol reaguje z p-DMAB, aby wytworzyć związek "fenolowo-czerwony związek fioletu (barwnik rindindolowy)", który ma różową barwę. Pierścień wytwarza się na powierzchni, ponieważ odczynnik wytwarza się w alkoholu amylowym.

W teście indolowym bakterie testowe hoduje się w pożywce bulionowej zawierającej tryptofan. Jeśli bakteria ma zdolność hydrolizowania tryptofanu do indolu, po dodaniu p-DMAB tworzy się różowy pierścień na powierzchni hodowli bulionowej.

Wymagane materiały:

Probówki, kolby stożkowe, kołpaki bawełniane, pętelki do inokulacji, autoklaw, palnik bunsena, komora laminarna, słoik utylizacyjny, inkubator, bulion tryptonowy, odczynnik Kovaca (paradimetyloaminobenzaldehyd), wyizolowane kolonie lub czyste kultury bakterii.

Procedura:

1. Składniki pożywki bulionowej tryptonu lub jej gotowego proszku wymaganego dla 100 ml bulionu odważa się i rozpuszcza w 100 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml, wstrząsając i wirując. Trypton działa jako źródło tryptofanu. Dlatego dodanie tryptofanu do bulionu jest opcjonalne (rysunek 7.3).

2. Jego pH określa się przy użyciu papieru lub pH-metru pH i dostosowuje się do 7, 5 za pomocą 0, 1N HCl, jeśli jest on większy lub stosując 0, 1 N NaOH, jeśli jest on mniejszy. Kolbę ogrzewa się, jeśli jest to wymagane, w celu całkowitego rozpuszczenia składników.

3. Bulion rozdziela się na pięć probówek (w przybliżeniu po 5 ml), bawełnianych, przykrytych papierem ściernym i przewiązanych nicią lub gumką.

4. Rurki bulionowe sterylizuje się w 121 ° C (ciśnienie 15 psi) przez 15 minut w autoklawie.

5. Rurki bulionu pozostawia się do ochłodzenia do temperatury pokojowej.

6. Badane bakterie zaszczepia się aseptycznie, najlepiej w komorze z przepływem laminarnym, za pomocą pętli inokulacyjnej wysterylizowanej na płomieniu bunsen. Pętla jest sterylizowana po każdej inokulacji.

7. Zaszczepione buliony bulionu inkubuje się w temperaturze 37 ° C przez 48 godzin w inkubatorze.

8. Odczynnik barwiący, para-dimetyloaminobenzaldehyd (p-DMAB), (tj. Odczynnik Kovaca) wkrapla się do probówek bulionowych (po 0, 5 ml) i obserwuje się po 1 minucie.

Alternatywnie:

7. Paski papieru nasączone kwasem szczawiowym umieszcza się w otworze zaszczepionych rurek bulionowych, tak aby około połowa pasków papieru pozostała wewnątrz rur bez dotykania bulionu, a druga połowa pozostaje na zewnątrz. W tym celu papier filtracyjny jest cięty na paski o długości około 35 mm i szerokości 5 mm. Paski są namaczane w gorącym nasyconym wodnym roztworze kwasu szczawiowego i suszone przed użyciem.

8. Zaszczepione buliony bulionu inkubuje się w temperaturze 37 ° C przez 48 godzin w inkubatorze.