Eksperyment do pielęgnowania i wyliczania bakteriofagów

Eksperyment do pielęgnowania i wyliczania bakteriofagów!

Zasada:

Zawiesinę bakterii, wrażliwych na bakteriofaga (wirusa, który infekuje bakterie) zaszczepiono tym bakteriofagiem i pozostawiono do wzrostu jako spłaszczony trawnik na płytce z agarem.

Cząstki bakteriofaga rosną w komórkach bakterii i ulegają ich lizie. Liza komórek bakteryjnych powoduje powstawanie wyraźnych stref w konfluentnym trawniku bakterii. Te czyste strefy nazywane są "tablicami". Zakłada się, że każda wolna strefa jest utworzona przez pojedynczą cząstkę bakteriofaga. Tak więc liczba jednostek tworzących łysinki (PFU) odpowiada liczbie bakteriofagów.

Technika rozcieńczeń seryjnych jest używana do wyliczenia bakteriofagów podobnych do tych, które są używane do wyliczenia bakterii. Liczbę cząstek faga zawartych w próbce oznacza się przez policzenie liczby płytek utworzonych na zaszczepionej płytce z agarem i pomnożenie przez współczynnik rozcieńczenia.

Aby ustalić prawidłową liczbę fagów, liczba płytek na płytkę nie powinna przekraczać 300 ani być mniejsza niż 30. Płytki wykazujące więcej niż 300 PFU są określane jako "zbyt liczne do zliczenia" (TNTC), natomiast płytki zawierające mniej niż 30 PFU są określane jako "zbyt mało, aby policzyć" (TFTC).

Wymagane materiały:

Bulion tryptonowy, agar tryptonowy, agar tryptonowy, kolba stożkowa, probówki, sterylizowane szalki Petriego, waty bawełniane, hodowla bakteriofaga (kolyphyt Ex: T 2 ), pożywka hodowlana bakterii (Ex: Escherichia coli B), wyjałowione pipety, autoklaw, kąpiel w gorącej wodzie, palnik bunsena, komora laminarna, słoiczek utylizacyjny, inkubator.

Procedura:

1. Piętnaście pipet (w przypadku pipety ze stali nierdzewnej) i pięć szalek Petriego sterylizuje się w piecu z gorącym powietrzem w temperaturze 180 ° C przez 3 godziny. Ewentualnie można je pokryć papierem ściernym, związać nitką lub gumką i wysterylizować w autoklawie wraz z nośnikiem (rysunek 8.3).

2. Składniki pożywki bulionowej tryptonu lub jej gotowego proszku, wymagane dla 100 ml brzeczki, odważa się i rozpuszcza w 100 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml przez wstrząsanie i mieszanie. Jego pH doprowadza się do 7, 5, stosując 0, 1N HCl lub 0, 1 N NaOH, w razie potrzeby. Kolbę ogrzewa się, jeśli jest to wymagane, w celu całkowitego rozpuszczenia składników.

3. Bulion jest rozprowadzany w 10 probówkach (po 9 ml), z bawełną, przykrytych papierem ściernym i przewiązanych nicią lub gumką.

4. Składniki pożywki agarowej tryptonu lub jej gotowego proszku, wymagane dla 100 ml pożywki, odważa się i rozpuszcza w 100 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml, wstrząsając i wirując. Jego pH doprowadza się do 7, 5, stosując 0, 1N HCl lub 0, 1 N NaOH, w razie potrzeby. Kolbę ogrzewa się w celu całkowitego rozpuszczenia agaru w pożywce.

5. Ten ciekły ośrodek jest rozprowadzany w 5 probówkach (po 2 ml), waty bawełnianej, pokrytej papierem ściernym i przewiązany nicią lub gumką.

6. Składniki agaru tryptonowego z twardym podłożem agarowym lub jego gotowy proszek wymagany dla 100 ml pożywki waży się i rozpuszcza w 100 ml destylowanej wody w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml, ogrzewając po dostosowaniu pH do 7, 5. Kolba jest zatkana bawełną, pokryta papierem ściernym i przewiązana nicią lub gumką.

7. Probówki z 10 tryptonem, probówki z miękkim agarem z tryptonem i kolba z agarem z tryptonem o twardym podłożu są sterylizowane w autoklawie w temperaturze 121 ° C (ciśnienie 15 psi) przez 15 minut.

8. Sterylizowany twardy agar tryptonowy w kolbie stożkowej wlewa się do 5 sterylizowanych szalek Petriego aseptycznie, otrzymując 5 płytek z agarem tryptonowym.

9. Jeden ml hodowli podstawowej bakteriofaga (kolyphag Ex: T2) przenosi się aseptycznie, korzystnie w komorze z przepływem laminarnym, do probówki z tryptonem (9 ml), stosując sterylizowaną pipetę. To staje się 10-krotnym rozcieńczeniem (tj. 10 -1 ). Rozcieńcza się aseptycznie szeregowo z pozostałymi dziewięcioma bulionami, tak aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 10 -10 (rysunek 8.4).

10. Próbki 5 sterylizowanych probówek typu trypton są pobierane i ogrzewane na łaźni wodnej do temperatury 100 ° C, tak aby stopić agar. Probówki chłodzi się i stopione miękkie miękkie rurki utrzymuje się w 45 ° C.

11. Spośród powyższych 10 probówek zawierających fagi w różnych stężeniach, wybiera się pięć probówek (tj. 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10 -8 i 10 -9 ). Z tych probówek aseptycznie 1 ml każdego przenosi się do pięciu probówek typu tryptonowego z miękkim agarem, stosując oddzielne wysterylizowane pipety.

12. Dwie krople pożywki bulionowej bakterii (Ex: Escherichia coli B) przenosi się aseptycznie, korzystnie w komorze z przepływem laminarnym, do każdej probówki z miękkim agarem tryptonu zawierającej bakteriofaga w pięciu różnych stężeniach (10 -5 do 10 -9). ).

13. Zawartość pięciu probówek typu soft agar tryptonu zawierających bakteriofaga i bakterie miesza się szybko, obracając między dłońmi.

14. Zawartość aseptycznie wylewa się na pięć płytek agarowych z tryptonem oznaczonych 10-5 do 10-9, tworząc w ten sposób dwuwarstwowy preparat do hodowli płytek. Płytki delikatnie wiruje się i pozostawia do stwardnienia.

15. Płytki inkubuje się w odwróconej pozycji w 37 ° C w inkubatorze.

Obserwacje:

1. Wszystkie płytki obserwuje się dla jednostek tworzących łysinki (PFU), które rozwijają się jako czyste strefy na trawniku bakterii.

2. Do wyliczenia faga brane są pod uwagę tylko te płytki, które mają PFU między 30 a 300. Liczba PFU na każdej płytce jest zliczana. Płytki wykazujące więcej niż 300 PFU są oznaczone jako "zbyt liczne do zliczenia" (TNTC), podczas gdy płytki zawierające mniej niż 30 PFU są oznaczone jako "za mało do zliczenia" (TFTC). Takie płyty nie są brane pod uwagę.

3. W oparciu o obserwacje, liczbę bakteriofagów na ml hodowli faga podstawowego obliczono stosując następujący wzór.

Liczba fagów / ml = liczba współczynników rozcieńczenia PFUs X

Na przykład, jeśli liczba PFU wynosi 280 w rozcieńczeniu 10 -7, to liczba fagów w hodowli podstawowej faga wynosi 280 X 10 7 fagów / ml (= 2, 80 X 10 fag / ml).