Eksperyment, aby dowiedzieć się o zdolności bakterii do dekarboksylacji różnych aminokwasów (z rysunkiem)

Eksperymentuj, aby odkryć zdolność bakterii do dekarboksylacji różnych aminokwasów!

Zasada:

Niektóre bakterie mają zdolność dekarboksylacji różnych aminokwasów do odpowiednich amin i CO _2, ponieważ mogą wytwarzać odpowiednie enzymy "dekarboksylazy aminokwasu".

Wśród nich każda bakteria może dekarboksylować tylko niektóre aminokwasy, podczas gdy nie może dekarboksylować innych.

Tak więc aminokwasy, które bakteria może dekarboksylować i aminokwasy, których nie może być charakterystyczna dla bakterii. Test dekarboksylazy aminokwasu przeprowadza się, aby osobno zbadać zdolność bakterii do dekarboksylacji aminokwasów, takich jak lizyna, ornityna i argentyna, z wytwarzaniem C0 ₂ i odpowiednich amin, takich jak kadaweryna, putrescyna i agmatyna.

Jeśli bakterie to potrafią

dekarboksylan dowolny jeden lub więcej aminokwasów, wytwarzane są odpowiednie aminy, które są zasadowe (zasadowe), a zatem zwiększają pH zmieniając kolor purpury bromokrezolowej z żółtego na fioletowy.

W teście dekarboksylazy aminokwasowej bakterie testowe są hodowane beztlenowo w podłożu bulionowym zawierającym glukozę, bromokrezol i jeden z aminokwasów. Kolor bulionu zmienia się początkowo z fioletowego na żółty ze względu na spadek pH wynikający z kwasów wytwarzanych w wyniku fermentacji glukozy. Jeśli bakteria ma zdolność dekarboksylacji aminokwasu, kolor bulionu zmienia się z żółtego z powrotem w fioletowy.

Wymagane materiały:

Probówki, kolby stożkowe, kołpaki bawełniane, pętelki do inokulacji, autoklaw, palnik bunsena, komora laminarna, saszetka utylizacyjna, inkubator, bulion dekarboksylazy aminokwasu, aminokwasy (lizyna, ornityna, arginina), ciekła parafina, izolowane kolonie lub czyste kultury bakteria.

Procedura:

1. Składniki pożywki bulionowej dekarboksylazy aminokwasu (zawierającej glukozę i fiolet bromokrezolowy jako główne składniki) lub jej gotowy proszek wymagany do 400 ml bulionu odważa się i rozpuszcza w 400 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 500 ml przez potrząsanie i mieszanie (rysunek 7.11).

2. Jego pH określa się przy użyciu papieru lub pH-metru pH i doprowadza się do 7, 2 za pomocą 0, 1 N HCl, jeśli jest to więcej lub stosując 0, 1 N NaOH, jeśli jest on mniejszy. Kolbę ogrzewa się, jeśli jest to wymagane, w celu całkowitego rozpuszczenia składników.

3. Bulion o pojemności 400 ml rozprowadza się w czterech kolbach stożkowych o pojemności 250 ml, tak aby każda kolba zawierała 100 ml brzeczki.

4. Do trzech kolb dodaje się trzy aminokwasy, takie jak lizyna, ornityna i arginina (po 0, 5 grama), a jedną utrzymuje się bez żadnego aminokwasu, który służy jako kontrola. Kontrola służy do rozróżniania dwustopniowych zmian koloru w medium testowym (tj. Z fioletowego na żółty iz żółtego z powrotem na fioletowy).

5. Buliony w czterech kolbach stożkowych są podzielone na cztery oddzielne zestawy probówek (około 10 ml każdy), bawełnianych, pokrytych papierem ściernym i przewiązanych nicią lub gumką.

6. Rurki bulionowe sterylizuje się w 121 ° C (ciśnienie 15 psi) przez 15 minut w autoklawie.

7. Rurki bulionu pozostawia się do ochłodzenia do temperatury pokojowej.

8. Płynna parafina jest sterylizowana przez ogrzewanie w temperaturze 180 ° C przez 3 godziny w piecu z gorącym powietrzem.

9. Bakterie testowe zaszczepiono w sposób aseptyczny, najlepiej w komorze z przepływem laminarnym, do bulionu za pomocą sterylizowanej pętli inokulacyjnej nad płomieniem bunsen. Pętla jest sterylizowana po każdej inokulacji.

10. Sterylizowaną parafinę płynną delikatnie wlewa się aseptycznie do zaszczepionych probówek, (około 1 cm wysokości na podłożu), aby zapewnić warunki beztlenowe.

11. Probówki z zaszczepionymi bulionami inkubuje się w temperaturze 37 ° C w inkubatorze i obserwuje codziennie, aż wynik będzie pozytywny lub maksymalnie przez 4 dni.