Eksperyment do identyfikacji nieznanych bakterii (z rysunkiem)
Eksperyment do identyfikacji nieznanych bakterii!
Zasada:
Identyfikacja nieznanych bakterii jest jednym z głównych obowiązków mikrobiologów. Próbki krwi, tkanek, żywności, wody i kosmetyków są codziennie badane w laboratoriach na całym świecie pod kątem obecności zanieczyszczających mikroorganizmów.
Ponadto organizacje przemysłowe stale badają materiały w celu wyizolowania nowych mikrobów lub drobnoustrojów produkujących antybiotyki, które zwiększą wydajność rynkowych produktów, takich jak witaminy, rozpuszczalniki i enzymy. Po wyizolowaniu te nieznane drobnoustroje muszą zostać zidentyfikowane i sklasyfikowane.
Nauka klasyfikacji nazywa się taksonomią i zajmuje się separacją żywych organizmów w powiązane ze sobą grupy. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. wydanie, jest oficjalnym kluczem taksonomicznym zawierającym zamówienia, rodziny, rodzaje i gatunki wszystkich znanych, zaklasyfikowanych bakterii (Załącznik III).
Dzięki podstawowej wiedzy w zakresie metod barwienia, technik izolacji, odżywiania bakterii, aktywności biochemicznej i cech rozwojowych bakterii, łatwiejsze jest zidentyfikowanie wszelkich nieznanych bakterii.
Charakterystykę niektórych bakterii podano w tabeli 7.2. Inne bakterie można zidentyfikować w podobny sposób na podstawie obserwacji i wyników uzyskanych po procedurach eksperymentalnych.
Wymagane materiały:
Slajdy, szkiełka, szalki Petriego, kolby stożkowe, kołki bawełniane, pętla do inokulacji, autoklaw, palnik bunsena, komora laminarna, saszetka utylizacyjna, inkubator, bulion odżywczy, agar odżywczy, odczynniki do barwienia gramów, podłoża i odczynniki do testów biochemicznych, mikroskop złożony, wyizolowane kolonie lub czyste kultury bakterii.
Procedura:
1. Przeprowadza się barwienie nieznanych bakterii metodą Grama. Poza barwieniem gramowym odnotowuje się także jego morfologię i układ. Test ruchliwości bakterii określa się za pomocą wiszącego preparatu kroplowego (rysunek 7.25).
2. Stosując jałową technikę inokulacji, bakterie zaszczepiono na dwóch skłdach agarowych pożywki, pożywce bulionowej i na pożywce agarowej za pomocą inokulacji smugami. Po inkubacji stosuje się jedną hodowlę skosową w celu określenia cech kulturowych nieznanych bakterii.
Drugi jest używany jako pod-kultura, jeśli konieczne będzie powtórzenie któregokolwiek z testów. Charakterystyki wzrostu obserwuje się również w probówce bulionowej i cechach kolonii na płytce.
3. Zachowując ostrożność w sterylnej technice, aby nie zanieczyszczać kultur, a tym samym uzyskać fałszywe wyniki, bakterie zaszczepia się w odpowiednich pożywkach w celu przeprowadzenia różnych testów biochemicznych.
4. Zaszczepione pożywki inkubuje się w wymaganych temperaturach przez wymagany okres czasu.
Obserwacje:
1. W przypadku barwienia w gramach, poza reakcją gramową, rejestrowano również morfologię i rozmieszczenie bakterii.
2. Zauważono kulturową charakterystykę bakterii w pożywce bulionowej, na skosie agarowym i na płytce agarowej pożywki.
3. Rejestrowane są wyniki reakcji biochemicznych.
Interpretacja wyników:
1. Wykorzystując powyższe zarejestrowane dane (np. Patrz Tabela 7.1) i przy pomocy Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, bakterie identyfikuje się pod względem rodzaju i gatunku. Należy pamiętać, że wyniki mogą się różnić w zależności od szczepów każdego wykorzystanego gatunku i długości czasu utrzymywania bakterii w hodowli podstawowej.
Obserwowane wyniki mogą nie być całkowicie identyczne z oczekiwanymi wynikami. Dlatego wybiera się bakterie, które najlepiej pasują do wyników. Charakterystyczne cechy niektórych bakterii podano w tabeli 7.2.
2. Alternatywnie, używając wyżej wymienionych danych, podano numery kodowe dla zarejestrowanych wyników (patrz Tabela 7.3), a bakterie zidentyfikowano łatwo za pomocą programu komputerowego dostępnego dla Apple II, IBM PC lub TRS-80.
Program ma na celu zidentyfikowanie nieznanych bakterii na podstawie procentu podobieństwa między nieznanymi bakteriami i znanymi bakteriami w odniesieniu do powyższych obserwacji.
Aby zainicjować program dla Apple II lub IBM-PC:
(a) Dysk zostanie włożony do lewego dysku.
(b) Komputer jest włączony.
(c) Po instrukcjach programu następuje wpisanie odpowiedzi, nieznanego numeru bakterii i numerów kodowych, gdy pytania pojawiają się na ekranie.
Aby zainicjować program dla TRS-80:
(za) Komputer jest włączony.
(b) Dysk zostanie włożony do dolnego napędu.
(do) Pomarańczowy przycisk jest wciśnięty.
(re) Na pytanie "wprowadzono datę (MM / DD / RR").
(mi) Ponownie naciśnięto pomarańczowy przycisk.
(f) Po instrukcjach programu następuje wpisanie odpowiedzi, nieznanego numeru bakterii i numerów kodowych, gdy pytania pojawiają się na ekranie.
E. Zautomatyzowane metody identyfikacji nieznanych bakterii:
Identyfikacja nieznanych bakterii metodą ręczną z wykorzystaniem reakcji barwienia, testu ruchliwości, cech kulturowych i testów biochemicznych jest uciążliwym, długim i czasochłonnym procesem. Aby proces był łatwy i krótki, opracowano metody automatyczne.
Metody te wykorzystują zasadniczo te same testy biochemiczne, jakie są stosowane w metodach ręcznych, ale tutaj odbywa się to w sposób automatyczny, a interpretacja odbywa się za pomocą programu komputerowego.
Dwa takie obecnie stosowane systemy do automatycznej identyfikacji bakterii są następujące:
1. System MINI API
2. System VITEK 2
F. Dalsze potwierdzenie:
(1) Testy serologiczne:
Testy serologiczne mogą być wykonywane dla dalszego potwierdzenia zidentyfikowanych bakterii. Do zawiesiny zidentyfikowanych bakterii (powiedzmy X), wymieszano kroplę antysurowicy (anty-X) przeciwko tej bakterii. Jeśli prowadzi to do tworzenia grudek lub osadów (kompleks X-anti-X), to identyfikacja zostaje potwierdzona.
Surowice odpornościowe dla różnych bakterii są dostępne w handlu. Są produkowane komercyjnie w różnych laboratoriach. Surowica poszczególnych bakterii wytwarzana jest przez wstrzyknięcie zabitych lub osłabionych komórek tych bakterii (na przykład X) zwierzęciu laboratoryjnemu.
Jako mechanizm obronny, zwierzę-gospodarz wytwarza przeciwciała (anty-X) przeciwko tej bakterii, która pozostaje we krwi. Krew pobierana jest od tego zwierzęcia, a jego surowica jest izolowana specjalnymi technikami. Ta surowica zawierająca przeciwciało przeciwko tej bakterii jest nazywana surowicą odpornościową tych bakterii.
(2) Test PCR:
Test reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) jest szybką molekularną metodą potwierdzania zidentyfikowanych bakterii. Technika ta jest bardzo często stosowana do szybkiego i precyzyjnego wykrywania różnych bakterii i wirusów.