Badanie na bakteriach Galaktozyd Orto-nitrofenylu w celu ustalenia ich zdolności do hydrolizy orto-nitrofenylo-PD-galaktozydu

Przeczytaj ten artykuł, aby zapoznać się z wynikami testu na bakteriostatyd Orto-nitrofenylu na bakteriach, aby znaleźć ich zdolność do hydrolizy orto-nitrofenylo-PD-galaktozydu!

Zasada:

Niektóre bakterie mają zdolność fermentacji laktozy. Nazywa się je "bakteriami fermentującymi laktozę" lub "laktozy-fomenters".

Pozostałe, które nie mogą fermentować laktozy, nazywane są bakteriami niefermentującymi laktozę lub "laktozami nie-wziernikami".

Bakterie fermentujące laktozę mogą wytwarzać dwa enzymy, mianowicie "permeazę" i "β-galaktozydazę", które biorą udział w fermentacji laktozy. Permeaza pomaga w wejściu laktozy do komórek bakterii, podczas gdy β-galaktozydaza hydrolizuje laktozę do glukozy i galaktozy, β-galaktozydaza jest wewnątrzkomórkowym indukowalnym enzymem, którego wytwarzanie jest indukowane przez obecność laktozy w środowisku komórek bakterii.

Podczas gdy bakterie fermentujące laktozę mogą wytwarzać zarówno permeazę, jak i β-galaktozydazę, bakterie niefermentujące laktozę nie mogą wytwarzać permeazy, ale mogą lub nie mogą wytwarzać β-galaktozydazy. Test ONPG przeprowadza się w celu ustalenia zdolności bakterii niefermentujących laktozę do wytwarzania β-galaktozydazy.

W tym celu błonę komórkową komórek bakterii niefermentujących laktozę rozpuszcza się przez dodanie toluenu, tak aby uwolnić wszystkie enzymy wewnątrzkomórkowe, w tym P-galaktozydazę, jeśli są obecne. Enzym, β-galaktozydaza, hydrolizuje substrat ortolenofenylo-β-D-galktozyd (ONPG) do orto-nitrofenolu, który ma kolor żółty.

W teście galaktozydu orto-nitrofenylu (test ONPG) bakterie testowe hodowano na skosach z agarem z potrójnym cukrem (agar TSI), zawierających laktozę. Jeśli bakterie nie są fermentowane, jak wskazano przez czerwony i czerwony i pochyły, to w zawiesinie wytwarza się gęstą zawiesinę bakterii, do której dodaje się toluen, a następnie roztwór ONPG. Jeśli bakteria ma zdolność wytwarzania enzymu P-galaktozydazy, kolor zawiesiny bakterii zmienia się na żółty.

Wymagane materiały:

Probówki, kolby stożkowe, bawełniane korki, pętelka do inokulacji, igła do zaszczepiania, autoklaw, palnik bunsena, komora laminarna, saszetka utylizacyjna, inkubator, agar TSI, toluen, roztwór o-nitrofenylo-β-D-galaktozydu (ONPG), izolowane kolonie lub czyste kultury bakterii.

Procedura:

1. Składniki pożywki agarowej TSI (zawierającej 3 cukry i żelazo jako główne składniki) lub gotowy proszek wymagany dla 100 ml pożywki są odważane i rozpuszczane w 100 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml drżenie i wirowanie (rysunek 7.16).

2. Jego pH określa się przy użyciu papieru lub pH-metru pH i doprowadza się do 7, 4 za pomocą 0, 1N HCl, jeśli jest on większy lub stosując 0, 1 N NaOH, jeśli jest on mniejszy.

3. Kolbę ogrzewa się w celu całkowitego rozpuszczenia agaru w podłożu.

4. Zanim się zestali, podłoże w stanie ciepłym stopionym rozdziela się na 5 probówek (w przybliżeniu po 20 ml).

5. Probówki są z bawełny, pokryte papierem ściernym i związane nicią lub gumką.

6. Są sterylizowane w 121 ° C (ciśnienie 15 psi) przez 15 minut w autoklawie.

7. Po sterylizacji są one usuwane z autoklawu i utrzymywane w pozycji skośnej w celu schłodzenia i zestalenia podłoża, tak aby uzyskać skosy agaru TSI.

8. Badane bakterie zaszczepia się w warunkach aseptycznych, najlepiej w komorze z przepływem laminarnym, w skosy przez wbicie w tyłek i smugi na powierzchni skosów za pomocą sterylizowanej płomieniem igły. Igła jest sterylizowana po każdej inokulacji.

9. Zaszczepione skosy inkubuje się w temperaturze 37 ° C przez 24 godziny w inkubatorze.

10. Jeśli bakteria jest fermentatorem laktozowym, nie jest wybrana do testu ONPG. Jeśli bakteria jest niefermentująca laktoza, jak wskazano przez czerwony i czerwony tyłek, to jest wybrana do testu ONPG.

11. Do probówki zawierającej 0, 25 ml soli fizjologicznej, grubą hodowlę bakterii umieszcza się za pomocą sterylizowanej płomieniowo pętli, tak aby uzyskać gęstą zawiesinę bakterii.

12. Dodaje się jedną kroplę toluenu, miesza i inkubuje przez 5 minut w 37 ° C.

13. Dodaje się roztwór galaktozydu O-nitrofenylu (roztwór ONPG) i inkubuje w 37 ° C przez 30 minut. Następnie obserwuje się zmianę koloru. Ponownie zmianę barwy obserwuje się po 24 godzinach.