Test oksydazy na bakteriach, aby dowiedzieć się ich zdolności do hydrolizy żelatyny poprzez wytwarzanie żelatyny

Test oksydazy na bakteriach, aby dowiedzieć się ich zdolności do hydrolizy żelatyny poprzez produkcję żelatyny!

Zasada:

Niektóre bakterie mają zdolność hydrolizowania żelatyny, ponieważ mogą wytwarzać enzym proteolityczny "żelatynaza".

Podczas gdy żelatyna zostaje wytrącona przez translucencję chlorku rtęci, jej hydrolizowane produkty końcowe nie zostają strącone przez chlorek rtęci, dla którego nie wytwarzają takiej przezroczystości, raczej wytwarzają przezroczystość.

W próbie żelatynowej badane bakterie hoduje się na płytkach agarowych zawierających żelatynę. Po zauważeniu kolonii bakterii, płytki są zalewane roztworem chlorku rtęci. Jeśli bakterie mają zdolność hydrolizy żelatyny, jej kolonie hydrolizują żelatynę w podłożu w otaczających je obszarach, podczas gdy reszta obszarów płytek zachowuje niehydrolizowaną żelatynę.

W rezultacie, po zatopieniu roztworem chlorku rtęciowego, wokół kolonii powstają przezroczyste strefy przezroczyste, ponieważ powstałe wokół nich hydrolizowane produkty nie tworzą osadu z chlorkiem rtęci. Z drugiej strony, pozostałe obszary płytek stają się półprzezroczyste, ponieważ niehydrolizowana żelatyna w tych obszarach tworzy osad z chlorkiem rtęci.

Wymagane materiały:

Szalki Petriego, kolby stożkowe, kołpaki bawełniane, pętelka do inokulacji, autoklaw, palnik bunsena, komora laminarna, słoik utylizacyjny, inkubator, żelatynowy agar Fraizer, roztwór chlorku rtęci, wyizolowane kolonie lub czyste kultury bakterii.

Procedura:

1. Dwie szalki Petriego są czyszczone, przykrywane papierem ściernym i wiązane nicią lub gumką (rysunek 7.20). Ten krok, jak również sterylizacja szalek Petriego w etapie 6, są pomijane, jeśli płytki Petriego wyjaławiane przez pieca są używane bezpośrednio

2. Składniki podłoża agarowego z żelatyny Fraizera (zawierające żelatynę jako główny składnik) lub jego gotowy proszek wymagany do napełnienia 100 ml pożywki są odważane i rozpuszczane w 100 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml poprzez wytrząsanie i mieszanie .

3. Wartość pH ustala się za pomocą papieru lub pH-metru pH i doprowadza się do 7, 2 za pomocą 0, 1N HCl, jeśli jest on większy lub stosuje 0, 1 N NaOH, jeśli jest on mniejszy.

4. Kolbę ogrzewa się w celu całkowitego rozpuszczenia agaru w podłożu.

5. Kolba jest bawełniana, pokryta papierem ściernym i przewiązana nicią lub gumką.

6. Dwie szalki Petriego i kolbę stożkową zawierającą żelatynową pożywkę agarową Fraizer sterylizuje się w 121 ° C (ciśnienie 15 psi) przez 15 minut w autoklawie.

7. Po sterylizacji są one usuwane z autoklawu i pozostawione do ostygnięcia przez jakiś czas, nie dopuszczając do zestalenia się ośrodka. Chłodzenie medium zapobiega kondensacji i gromadzeniu się kropel wody wewnątrz płytek. Jeśli podłoże zostało już przygotowane i zestalone podczas przechowywania, musi zostać upłynnione przez ogrzewanie ostrożnie, aż całkowicie się rozpuści.

8. Aby przygotować żelatynowe płytki agarowe, zanim sterylizowany agar żelatynowy agaru Frazier ochłodzi się i zestala, w ciepłym stanie stopionym, wylewa się go aseptycznie, najlepiej w komorze laminarnej, na dwie wysterylizowane szalki Petriego (w przybliżeniu po 20 ml), tak aby że stopione medium całkowicie pokrywa dno szalek Petriego.

Następnie płytki pokrywa się pokrywami i pozostawia do ochłodzenia, aby zestalić w nich medium. Para wodna, która może kondensować się na wewnętrznej powierzchni płytek i pokrywek, odparowuje się, utrzymując płytki i pokrywy w pozycji odwróconej w inkubatorze w 37 ° C przez około 1 godzinę.

9. Każda płyta jest oznaczona na dolnej stronie na cztery kwadraty.

10. "Miejsce inokulacji" badanych bakterii odbywa się w warunkach aseptycznych, najlepiej w komorze laminarnej, pośrodku każdej ćwiartki, wykonując plamkę (lub niewielką rozmaz) bakterii za pomocą sterylizowanej płomieniowo pętli. Pętla jest sterylizowana po każdej inokulacji.

11. Zaszczepione płytki inkubuje się w pozycji odwróconej, z góry do dołu, w temperaturze 37 ° C przez 24 do 48 godzin w inkubatorze, aż do pojawienia się kolonii bakterii.

12. Płytki są zalewane roztworem chlorku rtęci (HgCl ₂ ).