Test oksydazy na bakteriach, aby dowiedzieć się ich zdolność do utleniania zredukowanego cytochromu C

Przeczytaj ten artykuł, aby zapoznać się z testem oksydazy Bakterii, aby dowiedzieć się ich zdolności do utleniania zredukowanego cytochromu C:

Zasada:

Niektóre bakterie mają zdolność oksydazy "zredukowanego cytochromu C" obecnego w swoich komórkach do "utlenionego cytochromu C", ponieważ mogą wytworzyć enzym "oksydazę cytochromową".

Utleniony cytochrom C wytwarza purpurowy kolor (fiolet Wurstera) z barwnikiem N-tetrametylo-para-fenylenodiaminowym (tj. Odczynnikiem oksydazy).

W teście oksydazy, płytki agarowe pożywki zawierające kolonie badanych bakterii są zalewane roztworem odczynnika oksydazy. Jeśli bakterie mają zdolność wytwarzania enzymu oksydazy cytochromowej, kolor kolonii na płytkach zmienia się na fioletowy. Jeśli bakterie nie mają zdolności wytwarzania oksydazy cytochromowej, kolonie zachowują oryginalny różowy odczynnik oksydazy.

Wymagane materiały:

Szalki Petriego, kolby stożkowe, bawełniane zatyczki, platynowa pętla do inokulacji drutu, autoklaw, palnik bunsena, komora laminarnego przepływu, saszetka utylizacyjna, inkubator, pas bibuły filtracyjnej Whatman, odczynnik oksydazy (N-tetrametylo-para-fenylenodiamina), wyizolowane kolonie lub czyste kultury bakterii.

Procedura:

(a) Metoda płytkowa:

1. Dwie szalki Petriego są czyszczone, przykrywane papierem ściernym i wiązane nicią lub gumką (rysunek 7.19). Te etapy, jak również sterylizacja szalek Petriego w etapie 6, pomija się, jeśli płytki Petriego sterylizowane w piecu są stosowane bezpośrednio.

2. Składniki odżywczego podłoża agarowego lub jego gotowego proszku wymagane dla 100 ml pożywki są ważone i rozpuszczane w 100 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml poprzez wstrząsanie i mieszanie.

3. Jego pH określa się przy użyciu papieru lub pH-metru pH i doprowadza się do 7, 0, stosując 0, 1N HCl, jeśli jest on większy lub stosując 0, 1 N NaOH, jeśli jest on mniejszy.

4. Kolbę ogrzewa się w celu całkowitego rozpuszczenia agaru w podłożu.

5. Kolba jest bawełniana, pokryta papierem ściernym i przewiązana nicią lub gumką.

6. Dwie szalki Petriego i stożkowa kolba zawierające odżywcze podłoże agarowe sterylizuje się w 121 ° C (ciśnienie 15 psi) przez 15 minut w autoklawie.

7. Po sterylizacji są one usuwane z autoklawu i pozostawione do ochłodzenia przez pewien czas, nie dopuszczając do zestalenia się ośrodka. Chłodzenie medium zapobiega kondensacji i gromadzeniu się kropel wody wewnątrz płytek. Jeśli podłoże zostało już przygotowane i zestalone podczas przechowywania, musi zostać upłynnione przez ogrzewanie ostrożnie, aż całkowicie się rozpuści.

8. Aby przygotować odżywcze płytki agarowe, zanim sterylizowany podłoże agarowe zostanie schłodzone i zestalone, w stanie ciepłym, w stanie stopionym, wylewa się je aseptycznie, najlepiej w komorze laminarnej, na dwie wysterylizowane szalki Petriego (w przybliżeniu po 20 ml), tak aby stopione medium całkowicie pokrywa dno szalek Petriego.

Następnie płytki pokrywa się pokrywami i pozostawia do ochłodzenia, aby zestalić w nich medium. Para wodna, która może kondensować się na wewnętrznej powierzchni płytek i pokrywek, odparowuje się, utrzymując płytki i pokrywy w odwróconej pozycji w inkubatorze w temperaturze 37 ° C przez około 1 godzinę.

9. Każda płyta jest oznaczona na dolnej stronie na cztery kwadraty.

10. "Miejsce inokulacji" badanych bakterii wykonuje się w warunkach aseptycznych, najlepiej w komorze z przepływem laminarnym, pośrodku każdej ćwiartki, wykonując plamkę (lub niewielką rozmaz) bakterii za pomocą sterylizowanej płomieniowo pętli. Pętla jest sterylizowana po każdej inokulacji.

11. Zaszczepione płytki inkubuje się w pozycji odwróconej, z góry do dołu, w 37 ° C przez 24 godziny w inkubatorze, aż do zauważenia kolonii bakterii.

12. Płytki są zalewane odczynnikiem oksydazy.

(b) Metoda papieru:

1. Pasek papieru z bibuły Whatman zanurzony w 1% roztworze oksydazy jest suszony i utrzymywany w ciemności.

2. Przed użyciem zwilża się i pętlę badanych bakterii umieszcza się na niej za pomocą pętli platynowej. Pętla Nichromiego może utleniać odczynnik. Dlatego należy użyć pętli platynowej.

3. Miejsce jest obserwowane po 10 sekundach.

Obserwacje:

(a) Metoda płytkowa:

1. Kolor fioletowy rozwija się na koloniach bakterii: pozytywny dla oksydazy.

2. Kolor fioletowy nie rozwija się w koloniach

(Zachowany różowy kolor odczynnika oksydazy): Oxydaza ujemna.

(b) Metoda papieru:

1. Na miejscu pojawia się fioletowy kolor: pozytywny dla oksydazy.

2. Kolor fioletowy nie rozwija się na miejscu: Oxydaza ujemna.