Najnowsze postępy w diagnostyce malarii

Najnowsze postępy w diagnostyce malarii - HL Gupta, VK Talwar, A Rohtagi!

Wprowadzenie:

W Indiach malaria jest poważnym problemem zdrowotnym; W Radżastanie i północno-wschodnich stanach wybuchały częste epidemie. W Radżastanie występuje częstość występowania P. falciparum. W Delhi P. vivax jest najczęstszym gatunkiem, ale napotyka się także na P. falciparum. Malaria, światowy problem, zabija rocznie od 1, 5 do 2, 7 miliona osób. Innymi słowy, zabija jedną osobę (często dziecko <5 lat) co 12 sekund. Co roku 300-500 milionów ludzi jest zarażonych tą chorobą.

Dla kontroli choroby najważniejsza jest szybka i precyzyjna diagnoza. Rozpoznanie malarii często podejmuje się jedynie na podstawie objawów klinicznych, chociaż jego dokładność wynosi w najlepszym razie 50%. Nowsze, zaawansowane techniki diagnostyczne są już dostępne. Ostatnio wprowadzone badania oparte na teście immunologicznym są szybkie (<10 min / test) i co najmniej tak samo czułe jak tradycyjna mikroskopia.

Mikroskopia świetlna: grube i cienkie plamy krwi:

Tradycyjnie akceptowaną procedurą laboratoryjną do diagnozy malarii były badania mikroskopowe Giemsa lub barwione krwią plamy polowe. Idealnie, krew powinna być uzyskana przez ukłucie palca; jednakże krew uzyskana przez nakłucie żyły i antykoagulant (EDTA lub heparyna) jest do przyjęcia, jeśli zostanie natychmiast zbadana. Należy wykonać zarówno grube, jak i cienkie rozmazania. Gęsta rozmaz, koncentruje krwinki czerwone 20 - 30 razy na małej powierzchni, zwiększa czułość techniki i jest znacznie lepsza niż cienkie rozmazy. Cienki rozmaz jest jednak bardziej szczegółowy.

Jest to akceptowalny złoty standard diagnozy, ale jest pracochłonny, a interpretacja wyników wymaga znacznej wiedzy specjalistycznej, w szczególności z niską parazytemią. Ponadto łatwo można przeoczyć pasożyty P falciparum, które często są odseparowane od krwi obwodowej.

Kwantyfikacja pasożytów poprzez badanie rozmazów krwi:

Istnieje wiele metod oceny ilościowej występowania pasożytów malarycznych w grubych rozmazach. Poziomy pasożytów można również określić ilościowo przez badanie cienkiej rozmazu krwi. Główną wadą grubych smug jest to, że często wymaga pewnego stopnia wiedzy specjalistycznej, która może być niedostępna.

Teoretycznie egzaminator powinien liczyć poletka grube, zawierające 20 lub więcej leukocytów / hpf. W rzeczywistości pola zawierające 20 lub więcej leukocytów są zbyt grube, aby je zliczyć, podczas gdy pola, które są najłatwiejsze do odczytania, to te, które zawierają tylko pięć lub sześć leukocytów / hpf.

Przed przystąpieniem do barwienia, egzaminator powinien być w stanie odczytać wydruk przez dobrze przygotowaną, grubą rozmazę krwi. Badanie cienkich wymazów jest tylko jedną dziesiątą tak wrażliwą, jak badanie grubych wymazów. Tak więc, chociaż badanie rozmazów krwi jest dopuszczalne jako uniwersalny "złoty standard", tak naprawdę nie ma jednej, standardowej metody, stosowanej przez wszystkich badaczy, do kwantyfikacji pasożytów poprzez liczenie pasożytów w grubych rozmazach.

Ponadto, pod przeszkolonym personelem, brak mikroskopów ogranicza przydatność badania rozmazu krwi w wielu obszarach endemicznych. Uznając te ograniczenia, opracowano alternatywne techniki diagnozy malarii.

Mikroskopia fluorescencyjna:

Trzy techniki fluorescencyjne obiecują rozpoznanie malarii.

To są:

(i) Metoda ilościowej ufoluktywności (OBC) dostępna jako zestaw handlowy

(ii) Proces Kawamoto Acridine Orange (AO) i

(iii) Procedura Benzothiocarboxypurine (BCP).

Te trzy techniki są szybkie i łatwe do wykonania; gdy występuje więcej niż 100 pasożytów / μL, wykazują one czułość i swoistość równoważną z osiąganą przez badanie rozmazu grubego.

W metodach OBC i Kawamoto stosuje się Acridine Orange (AO) jako fluorochrom w celu barwienia kwasów nukleinowych pasożytów malarycznych w próbce. BCP jest także fluorochromem, który barwi kwasy nukleinowe. AO jest niespecyficzne i barwiące kwasy nukleinowe ze wszystkich typów komórek.

W związku z tym egzaminator musi nauczyć się odróżniać barwione fluorescencyjnie pasożyty od innych komórek i szczątków komórkowych. Czułość barwienia AO przy poziomach pasożytów poniżej 100 pasożytów / μL wynosiła 41, 7-93%.

Swoistość barwienia AP dla P. vivax i P. falciparum wynosi odpowiednio 52 i 93 procent. Metoda BCP ma czułość i swoistość większą niż 90%. Ważnym ograniczeniem metod opartych na AO i BCP jest ich niezdolność do rozróżnienia wśród gatunków Plasmodium. AO jest niebezpieczne i wymaga specjalnych wymagań dotyczących usuwania.

OBC i BCP są bardziej wymagające technicznie niż Kawamoto. Metody Kawamoto i AO wymagają specjalnego wyposażenia i materiałów i są droższe. Cena mikroskopu fluorescencyjnego może być czynnikiem ograniczającym dla laboratoriów zainteresowanych wykorzystaniem tych metod.

Wykrywanie określonych sekwencji kwasu nukleinowego:

Pomocne może być wykrywanie sekwencji kwasów nukleinowych charakterystycznych dla pasożytów Plasmodium. W technikach opartych na PCR amplifikowana sekwencja docelowa jest wykrywana przez wewnętrzne sondy lub analizowana za pomocą elektroforezy żelowej. Główną zaletą stosowania techniki opartej na PCR jest zdolność do wykrywania "niskiej parazytemii". Infekcje żywymi pasożytami można wykryć ze 100% swoistością.

Takie techniki są jednak kosztowne i pracochłonne, wymagają rozległej wiedzy technicznej, obejmują wiele etapów i nie mogą być stosowane do rozróżniania żywych i nieżywotnych organizmów.

Inhibitory PCR naturalnie obecne w próbkach krwi mogą powodować znaczną liczbę wyników fałszywie ujemnych. Wyniki fałszywie dodatnie, ze względu na zanieczyszczenie przenoszeniem, również zostały zarejestrowane.

Do przesiewania dawców w miejscu, w którym malaria jest chorobą endemiczną, zastosowano techniki oparte na PCR. Czułość i swoistość metod opartych na PCR, oszacowanych na podstawie badania rozmazu krwi jako "złotego standardu", wynosi 90 procent lub więcej.

Ponadto dalsze postępy w technologii PCR mogą wkrótce umożliwić odróżnienie żywych pasożytów od nieżywotnych. Obecnie przydatność takiej technologii jest ograniczona potrzebą drogiego, wyspecjalizowanego sprzętu laboratoryjnego, personelem przeszkolonym w zakresie technologii genetycznych i urządzeń "czystych pomieszczeń" oraz wysokim kosztem zastosowanych enzymów i starterów.

Wykrywanie antygenu:

Testy wykrywania przeciwciał na malarię miały ograniczoną czułość i zdolność odróżniania aktywnych od uprzednich infekcji. Testy wychwytywania antygenów nowej generacji są w stanie wykryć mniej pasożytów i uzyskać szybkie wyniki (10-15 minut). Są to komercyjnie dostępne zestawy, które zawierają wszystkie niezbędne odczynniki i nie wymagają intensywnego szkolenia ani sprzętu.

Istnieją dwa antygeny pasożytnicze stosowane w nowych, szybkich testach diagnostycznych, bogate w histydynę białko-2 (HRP-2), które jest wytwarzane tylko przez P. falciparum i antygen mleczanowej dehydrogenazy (pLDH) pasożyta, wytwarzany przez wszystkie cztery. gatunki infekujące człowieka. Oba antygeny są wydzielane do krwi przez wszystkie bezpłciowe etapy pasożyta; antygen pLDH jest również wytwarzany przez gametocyty.

Najnowsze testy przechwytywania antygenów są szybkie i proste w wykonaniu, a ich granice wykrywalności są porównywalne z tymi w wysokiej jakości mikroskopii (tj. 100-200 pasożytów / μL). Gdy występuje więcej niż 60-100 pasożytów / μL, HRP- Testy 2-składnikowe są wysoce (> 90%) czułe i (> 90%) specyficzne, w porównaniu z mikroskopią z grubym rozmazem.

Obecnie dwa takie testy są dostępne w handlu, test ParaSight F i test immunologiczny (immunochromatograficzny) Malaria Pf Test. Oba testy są wykonywane na próbkach pobranych z palca i wykrywają tylko malarię wywołaną przez P. falciparum.

Oparte są na monoklonalnych przeciwciałach HRP-2, które są unieruchamiane na paskach nitrocelulozy, w celu wytworzenia prętów lub testów tektury (test ICT Pf). W każdym teście pozytywny wynik jest wskazywany przez pojawienie się czerwonej linii na pasku testowym, gdzie przeciwciała monoklonalne są unieruchomione.

Oba testy zawierają również wbudowaną kontrolę; linia kontrolna musi pojawić się, aby test został uznany za ważny. Czułość i swoistość testu ParaSight F wynosi odpowiednio 88 i 97%, co jest porównywalne z PCR.

Chociaż testy serologiczne oparte na HRP-2 pozwoliły na szybką diagnozę malarii falciparum, mają one ograniczoną przydatność. Ponieważ HRP-2 występuje tylko w P. falciparum, testy oparte na wykrywaniu HRP-2 są negatywne z infekcją wywołaną przez żywy, jajowaty lub malarię.

Wiele przypadków malarii niezwiązanej z falciparum zostanie zatem źle zdiagnozowanych jako negatywne pod względem malarii. Kolejnym ograniczeniem testów opartych na HRP-2 jest to, że HRP-2 utrzymuje się w krwi długo po ustąpieniu klinicznych objawów, a pasożyty pozornie oczyściły się z gospodarza.

W rzeczywistości, HRP-2 został odkryty w mumiach. Testy na obecność tego antygenu mogą zatem nie być przydatne do badań przesiewowych na rdzennych obszarach endemicznych, u których może występować utrzymujący się parazytemia o niskim poziomie. Prawdopodobna przyczyna utrzymywania się antygenu HRP-2 nie jest dobrze znana; może odzwierciedlać obecność ukrytych, żywotnych pasożytów (prawdopodobnie w wyniku niepowodzenia leczenia) lub rozpuszczalnych kompleksów antygen-przeciwciało.

Trwałość może również zależeć od rodzaju zastosowanej terapii przeciwmalarycznej. Sygnał HRP-2 może utrzymywać się przez 19 dni po pozornie skutecznej terapii chininą i doksycykliną. Obserwowano również utrzymującą się antygenemię HRP-2 podczas i po terapii artemeter.

Inne ograniczenia są szczególnie związane z technicznymi aspektami systemu HRP-2. Na przykład, monoklonalne IgG stosowane w układzie ParaSight F mogą reagować krzyżowo z czynnikiem reumatoidalnym i powodować fałszywie dodatnią odpowiedź.

Test ICT Pf wykorzystuje monoklonalne IgM, które nie reaguje krzyżowo i nie ma doniesień o fałszywie dodatnich reakcjach zachodzących w tym teście z powodu czynnika reumatoidalnego. Test ICT Pf wymaga jednak przechowywania w temperaturze 4 ° C, co ogranicza jego przydatność w sytuacjach polowych.

Testy serologiczne na bazie pLDH:

Najnowsze szybkie testy serologiczne w diagnostyce malarii oparte są na wykrywaniu pLDH. Podobnie jak testy oparte na HRP-2, testy te są czułe, specyficzne i łatwe do wykonania, a wyniki można uzyskać w mniej niż 15 minut.

Testy oparte na pLDH są również w stanie rozróżnić między P. falciparum i innymi gatunkami Plasmodium, a ponieważ pLDH jest wytwarzany tylko przez zdolne do życia pasożyty, są one również użyteczne w monitorowaniu leczenia przeciwmalarycznego. pLDH z P. falciparum różni się od gospodarza LDH (h-LDH) z dinukleotydem 3-acetylopirydynoadeninowym (APAD), analogiem dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD).

Testy oparte na pLDH są dostępne w dwóch postaciach, półilościowych, suchych, z użyciem wskaźnika poziomu (OptiMAL); i ilościowy, immuno-enzymatyczny test wychwytu. Test OptiMAL wykorzystuje dwa przeciwciała monoklonalne, jeden specyficzny dla P. falciparum, a drugi rozpoznający wszystkie 4 Plasmodia.

Badana próbka krwi (10 μL ukłucia palcem, pełnej krwi lub zamrożonego hemolizatu) jest mieszana z 3 μ μl, bufor do lizy zawierający skoniugowane przeciwciało monoklonalne. Ta mieszanina może zanurzyć się w OptiMAL, prętowym wskaźniku.

Po 3 minutach dodaje się 100 μl buforu oczyszczającego. Jeśli w próbce krwi obecna jest P. falciparum, na paskach pojawiają się trzy linie (w tym jedna na górze każdego patyka, reprezentująca kontrolę pozytywną).

Dwie linie oznaczają P. vivax, P. malariae lub czasami P. ovale. Nowo sformatowany pasek OptiMAL-2 ma trzy linie testowe i dodatnią linię kontrolną, która pozwala zidentyfikować wszystkie cztery gatunki Plasmodium.

Każdy test jest uważany za prawidłowy tylko wtedy, gdy rozwija się linia kontrolna. Przeciwciała monoklonalne zastosowane w teście OptiMAL zostały wyczerpująco przetestowane pod kątem reaktywności krzyżowej z LDH z leiszmanii, babesji i chorobotwórczych bakterii lub grzybów i nie znaleziono dowodów na taką reaktywność krzyżową.

Stwierdzono, że HRP-2 utrzymuje się długo po ustąpieniu parazytemii obwodowej. Chociaż poziomy pLDH ściśle podążają za parazytemią obwodową i spadły do ​​niewykrywalnych wartości 3-5 dni po terapii chininą i doksycykliną, poziomy antygenu HRP-2 spadły tylko po 19 dniach, dużo później, gdy pacjent jest objawem i najwyraźniej wolnym od pasożyta.

Dlatego test OptiMAL powinien być cennym narzędziem monitorowania terapii przeciwmalarycznej. Klirens parazytemii i klirens pLDH wydają się wzajemnie się uzupełniać.

Testy OptiMAL są bardzo wszechstronne. Test OptiMAL ma czułość odpowiednio 94-88% i swoistość 100 i 99% odpowiednio dla P. vivax i P. falciparum w porównaniu z rozmazami krwi.

Test ten może być wykorzystywany jako narzędzie epidemiologiczne, ponieważ na obszarach, gdzie krąży więcej niż jeden gatunek Plasmodium, można go wykorzystać do szybkiego zidentyfikowania gatunków Plasmodium zakażających pacjentów w każdej wiosce i umożliwić pracownikom służby zdrowia dostarczanie najbardziej odpowiedniej chemioterapii. .

Wnioski:

W ciągu ostatnich kilku lat próby zastąpienia tradycyjnej i żmudnej lektury rozmazów krwi (metoda opracowana prawie 100 lat temu) doprowadziły do ​​technik wykrywania pasożytów malarii, które dają wrażliwość równoważną lub lepszą niż mikroskopia.

Chociaż metody oparte na PCR są prawdopodobnie najbardziej czułe, są one tak kosztowne i wymagają takiego specjalistycznego sprzętu i szkoleń, że jest mało prawdopodobne, aby były używane do rutynowej diagnostyki w większości krajów rozwijających się.

Są one szczególnie użyteczne w badaniach nad różnicami szczepów, mutacjami i genami zaangażowanymi w oporność na leki u pasożyta oraz w celu wykazania poziomu pokrewieństwa między szczepami powiązanymi z różnymi ogniskami malarii. Najbardziej obiecującą, nową diagnostyką malarii są serologiczne testy prętowe.

Testy te, w tym ParaSight F, ICT Pf Test i OptiMAL, są proste w użyciu, łatwe w interpretacji i dają wyniki w 15 minut lub krócej. Testy te są prawie tak samo czułe jak badanie mikroskopowe rozmazów krwi, ale nie wymagają wysoko wykwalifikowanego personelu do wykonywania lub interpretowania wyników.

Test OptiMAL ma dodatkowe zalety: jest w stanie wykryć wszystkie cztery gatunki Plaspiodium i podążać za skutecznością terapii lekowej, ponieważ mierzy enzym wytwarzany tylko przez żywe pasożyty.

Chociaż testy z użyciem wskaźnika poziomu posiadają dwa oczywiste ograniczenia, nie powinny również uniemożliwiać powszechnej akceptacji tych testów. Pierwszym ograniczeniem jest czułość. Trzy obecnie wprowadzane do obrotu testy mają progi wrażliwości 50-100 pasożytów / μ1. Czułość dla próbek z <50 pasożytami / μl wynosi konsekwentnie 50% -70%.

Ten poziom wrażliwości może nie stanowić większego problemu dla osób żyjących na stałe w obszarach endemicznych, które często nie są leczone, o ile nie mają więcej niż 500 pasożytów / μL krwi, ale mogą stanowić problem w diagnozowaniu malarii u osób, które pochodzą z obszarów nieendemicznych, ale żyją, pracują lub podróżują w obszarach endemicznych.

Jednakże, ponieważ ogromna większość pacjentów z malarią ma poziomy pasożytów znacznie powyżej 50 pasożytów / μl, kilku pacjentów byłoby błędnie zdiagnozowanych, gdyby testy paskowe były rutynowo stosowane. Drugim ograniczeniem takich testów, przynajmniej obecnie, jest ich koszt.

Światowa Organizacja Zdrowia uważa, że ​​dla osób z obszarów endemicznych korzystanie z nich w diagnostyce malarii powinno kosztować mniej niż 0, 40 USD / próbka. O ile testy bagnetowe nie są produkowane masowo, cena ta jest nieosiągalna i niepraktyczna dla producentów.

Bieżące koszty testów prętowych zależą od lokalizacji nabywcy i zamówionej objętości. Na przykład koszty testów ICT ICT sięgają od 1, 30 USD / test w krajach rozwijających się. Testy Para 0Sight F sprzedawane są za 1, 20 USD za test. Taśma optiMAL obecnie sprzedaje się za 3, 00 USD / test.