Barwienie Sporów Bakterii w celu Zróżnicowania Zarodników Bakterii i Komórki Wegetatywnej

Cel, powód:

Wszystkie bakterie pozostają w swoich "postaciach wegetatywnych", jeżeli warunki środowiskowe sprzyjają ich normalnej aktywności metabolicznej.

W tej formie pobierają składniki odżywcze, rosną i rozmnażają się.

Z drugiej strony, większość z nich umiera, gdy warunki środowiskowe stają się niekorzystne, takie jak, silne zimno, ekstremalne ciepło, starzenie się, brak składników odżywczych, narażenie na promieniowanie i toksyczne chemikalia.

Jednak niewiele gatunków bakterii może przetrwać w tak niekorzystnych warunkach, zmieniając się w bardzo oporne, metabolicznie nieaktywne formy zwane "zarodnikami". W niekorzystnych warunkach powstaje przetrwalnik w komórce wegetatywnej przez odwodnienie i kurczenie się zawartości komórek.

Ta przetrwalnik, utworzony wewnątrz komórki bakterii, nazywany jest "endosporą" (rysunek 2.13). Jeśli niekorzystne warunki pogorszą się, komórka pęka, uwalniając endosporę, która teraz staje się niezależną, nieaktywną komórką zwaną "zarodnikiem".

Proces tworzenia zarodników nazywany jest "sporogenezą". Zarodnik ma grube, stosunkowo nieprzepuszczalne warstwy, takie jak kora zarodników i płaszcz zarodników, które chronią komórkę przed uszkodzeniem fizycznym. Zarodnik zyskuje odporność dzięki kilku mechanizmom, które nie zostały jeszcze wyjaśnione w jasny sposób.

Gdy warunki staną się korzystne, warstwy pokrywające pęknięcie zarodników i zarodnik wywołują metabolicznie aktywne komórki wegetatywne. Proces ten nazywa się "kiełkowaniem".

Tak więc, w oparciu o zdolność do tworzenia przetrwalników, bakterie można podzielić na dwie grupy w następujący sposób:

(1) Bakterie tworzące przetrwalniki (związki przetrwalnikowe):

Bakteria, która może wytwarzać przetrwalnik w niesprzyjających warunkach środowiskowych, jest bakterią tworzącą przetrwalniki (środek przetrwalnikowy). Przeważnie następujące trzy rodzaje bakterii w kształcie pałeczki mogą wytwarzać zarodniki w niekorzystnych warunkach środowiskowych.

A. Tlenowe bakterie w kształcie prętów

1. Bacillus spp.

B. Beztlenowe bakterie w kształcie prętów

2. Clostridium spp.

3. Desulfotomaculum spp.

(2) Non-spore-forming Bacteria (Non-spore-formers):

Bakteria, która nie może wytworzyć zarodnika i dlatego umiera w swojej postaci wegetatywnej w niekorzystnych warunkach środowiskowych, jest bakterią nie tworzącą przetrwalników (niezwiązaną z przetrwalnikiem).

Celem barwienia przetrwalników jest odróżnienie zarodników i komórek wegetatywnych od sporozalążkowego oraz zróżnicowanie czynników tworzących przetrwalniki z formantów niesporejących. Barwienie zarodników jest również pomocne w identyfikacji bakterii należących do rodzajów Bacillus, Clostridium i Desulfotomaculum.

Zasada:

Zarodniki różnią się od komórek wegetatywnych tym, że mają wokół siebie grube, stosunkowo nieprzepuszczalne warstwy (ryc. 2.14). Pierwotna plama, zieleń malachitowa, nie może przeniknąć do zarodników przez te warstwy.

Dlatego penetracja pierwotnego plamki jest zwiększona przez zastosowanie ciepła, które przenosi ją przez warstwy pokrywające do protoplastu zarodnika. Teraz zarodniki są zielone. Gdy zarodniki są traktowane środkiem odbarwiającym, woda z kranu nie ulega odbarwieniu, ponieważ wykluczają wodę.

Woda z kranu usuwa jedynie nadmiar plamy pierwotnej obecnej w otoczeniu zarodników. Tak więc zarodniki zachowują zielony kolor. Następnie, gdy są zabarwione kontrastowo safraniną, cząsteczki safraniny nie mogą przedostać się do zarodników przez warstwy pokrywające. W końcu zarodniki zachowują zielony kolor pierwotnego zabarwienia i wyglądają na zielone.

Z drugiej strony, komórki bakterii wegetatywnych z łatwością przejmują pierwotne zabarwienie, malachitowe, ale plama nie ma silnego powinowactwa do składników komórek wegetatywnych, dzięki czemu jest wymywana, po odbarwieniu pod bieżącą wodą.

Teraz komórki wegetatywne wyglądają na bezbarwne. Po zabarwieniu kontrastowym safraniną, bezbarwne komórki wegetatywne przejmują plamę i wyglądają na czerwone, w przeciwieństwie do zarodników, które wyglądają na zielone.

Wymagane materiały:

Slajd, pętla, zieleń malachitowa, safranina, bakterie tworzące przetrwalniki, gorąca płyta, mikroskop, olej immersyjny.

Procedura:

1. Slajd jest prawidłowo czyszczony pod bieżącą wodą, tak aby woda nie pozostała jak krople na jego powierzchni.

2. Przylegającą wodę ściera się papierem z bibuły i suszy się na powietrzu.

3. Rozmazanie bakterii tworzących przetrwalniki odbywa się w środku szkiełka na dwie metody, jak podano poniżej.

(za) Jeśli obserwuje się spory-dawkę hodowaną na płytce agarowej lub na skos agarowy, kroplę wody umieszcza się pośrodku szkiełka. Pętla sterylizowana jest nad płomieniem, a pętla Clostridium bakterii z postarzałej płytki lub skośnej kultury (48-72 godzin) zarodników, takich jak supergeny Clostridium lub Bacillus subtilis, jest przenoszona do kropli wody.

Następnie, delikatnie obracając pętlę w kropli wody, wytwarza się zawiesinę bakterii i kroplę rozprowadza się aż do uzyskania rozmazu. Wraz ze wzrostem wieku bakterii tworzących przetrwalniki na kulturach płytkowych lub skośnych powstają zarodniki.

(b) Jeśli zaobserwuje się sporowate spory w płynnym bulionie, hodowle bulionowe, zawierające tylko komórki wegetatywne, są poddawane stresowi cieplnemu, przez ogrzewanie na łaźni wodnej przez 15 minut, tak, że niektóre komórki wegetatywne tworzą zarodniki, aby pokonać stres cieplny. Kroplę wymieszanej zawiesiny komórek zarodnikowo-wegetatywnych z hodowli bulionowej umieszcza się bezpośrednio pośrodku szkiełka za pomocą jałowej pętli i rozmazuje się przez rozprowadzanie.

4. Rozmaz suszy się powietrzem.

5. Rozmaz jest ustalany przez ogrzewanie. Ogrzewanie powoduje koagulację białek komórkowych, dzięki czemu komórki przyklejają się do powierzchni ślizgowej i nie zmywają się podczas barwienia. Utrwalanie cieplne wykonuje się przez szybkie przejście suwaka wysoko ponad płomień 2-3 razy, z rozmazem powierzchnia skierowana do góry, aby rozmaz nie został rozgrzany.

6. Rozmaz jest zalewany pierwotną plamą, zieloną malachitową.

7. Poślizg utrzymuje się na ciepłej gorącej płytce i preparat pozostawia się na parę w ciągu 2-3 minut. Temperatura gorącej płyty jest tak ustawiona, że ​​preparat się nie gotuje i szybko się odparowuje. Strata z parowania jest uzupełniana, aby rozmaz nie wyschnął.

8. Slajd wyjmuje się z gorącej płyty i chłodzi.

9. Rozmaz odbarwia się poprzez przemywanie pod delikatnie płynącą wodą z kranu w taki sposób, aby woda nie padała bezpośrednio na rozmaz.

10. Rozmaz zalewa się plamami, safraniną, przez 30 sekund.

11. Nadmiar plam przeciwprątkowych jest całkowicie wymywany z rozmazu pod delikatnie płynącą wodą wodociągową, w taki sposób, że woda nie spada bezpośrednio na rozmaz.

12. Slajd wysuszyć na bibułę za pomocą papieru bibułowego.

13. Slajd jest przytwierdzony do stolika mikroskopu, a rozmaz obserwowany przy niskiej mocy i wysokich suchych celach.

14. Na smugę nakłada się kroplę oleju immersyjnego.

15. Smużę obserwuje się pod obiektywnym zanurzeniem w oleju.

Obserwacje (w ramach celu "zanurzenie w oleju"):

1. Kolor komórek:

Zielony: Zarodnik (zwróć uwagę na lokalizację zarodnika)

Czerwony: komórka wegetatywna

2. Kształt bakterii:

Kulisty (coccus)

W kształcie pręta (pałeczki)

Comma-like (vibrio)

Spirala (krętki)

3. Rozmieszczenie bakterii:

Pary (diplobacillus / diplococcus)

W czwórce (tetradach)

W łańcuchach (streptococcus / streptobacillus)

Klastry przypominające winogrona (gronkowce)

Sześcienne (sarcinae lub oktet)

4. Rozmiar bakterii:

Oszacowując wzrok, wykonaj rysunek pola pod obiektywnym zanurzeniem w oleju.