Test hydrolizy skrobi na bakteriach w celu ustalenia ich zdolności do hydrolizy skrobi

Test hydrolizy skrobi na bakteriach, aby sprawdzić ich zdolność do hydrolizy skrobi!

Zasada:

Niektóre bakterie mają zdolność hydrolizowania skrobi, ponieważ mogą produkować enzym sacharynowy.

Podczas gdy skrobia tworzy ciemnoniebieski kolor z jodem, jej hydrolizowane produkty końcowe nie zyskują tak ciemnoniebieskiego koloru z jodem.

W teście hydrolizy skrobi badane bakterie hoduje się na płytkach agarowych zawierających skrobię. Po zauważeniu kolonii bakterii, płytki są zalewane roztworem jodu. Jeśli bakterie mają zdolność hydrolizowania skrobi, jego kolonie hydrolizują skrobię w pożywce w otaczających je obszarach, podczas gdy pozostałe obszary płytek zawierają niehydrolizowaną skrobię.

W rezultacie, po zalaniu roztworem jodu, wokół kolonii powstają przezroczyste strefy przezroczyste, ponieważ powstałe wokół nich produkty hydrolizowane nie tworzą ciemnoniebieskiego koloru z jodem. Z drugiej strony pozostałe obszary płytek stają się ciemnoniebieskie, ponieważ jod tworzy ciemnoniebieski kolor z niehydrolizowaną skrobią na tych obszarach.

Wymagane materiały:

Szalki Petriego, kolby stożkowe, kołpaki bawełniane, pętelka do inokulacji, autoklaw, palnik bunsena, komora laminarna, słoik utylizacyjny, inkubator, agar skrobiowy, roztwór jodu Lugola, wyizolowane kolonie lub czyste kultury bakterii.

Procedura:

1. Dwie szalki Petriego są czyszczone, przykrywane papierem ściernym i wiązane nicią lub gumką (rysunek 7.21). Ten etap, jak również sterylizacja szalek Petriego w etapie 6, pomija się, jeśli płytki Petriego sterylizowane w piecu są stosowane bezpośrednio.

2. Składniki podłoża agarowego ze skrobią (zawierające skrobię jako główny składnik) lub gotowy proszek potrzebny do napełnienia 100 ml pożywki są ważone i rozpuszczane w 100 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml poprzez wstrząsanie i mieszanie.

3. Wartość pH ustala się za pomocą papieru lub pH-metru pH i doprowadza się do 7, 2 za pomocą 0, 1N HCl, jeśli jest on większy lub stosuje 0, 1 N NaOH, jeśli jest on mniejszy.

4. Kolbę ogrzewa się w celu całkowitego rozpuszczenia agaru w podłożu.

5. Kolba jest bawełniana, pokryta papierem ściernym i przewiązana nicią lub gumką.

6. Dwie szalki Petriego i kolbę stożkową zawierającą skrobię w agarze są sterylizowane w 121 ° C (ciśnienie 15 psi) przez 15 minut w autoklawie.

7. Po sterylizacji są one usuwane z autoklawu i pozostawione do ochłodzenia przez pewien czas, nie dopuszczając do zestalenia się ośrodka. Chłodzenie medium zapobiega kondensacji i gromadzeniu się kropel wody wewnątrz płytek. Jeśli podłoże zostało już przygotowane i zestalone podczas przechowywania, musi zostać upłynnione przez ogrzewanie ostrożnie, aż całkowicie się rozpuści.

8. W celu przygotowania płytek agarowych ze skrobią, przed stwardnieniem i stwardnieniem podłoża agarowego sterylizowanego skrobi, w stanie ciepłym, w stanie stopionym, wylewa się go aseptycznie, najlepiej w komorze laminarnej, na dwie wysterylizowane szalki Petriego (w przybliżeniu po 20 ml), tak aby stopione medium całkowicie pokrywa dno szalek Petriego.

Następnie płytki pokrywa się pokrywkami i pozostawia do ochłodzenia, aby zestalić w nich medium. Para wodna, która może kondensować się na wewnętrznej powierzchni płytek i pokrywek, odparowuje się, utrzymując płytki i pokrywki w odwróconej pozycji w inkubatorze w temperaturze 37 ° C przez około 1 godzinę.

9. Każda płyta jest oznaczona na dolnej stronie na cztery kwadraty.

10. "Miejsce inokulacji" badanych bakterii odbywa się w warunkach aseptycznych, najlepiej w komorze laminarnej, pośrodku każdej ćwiartki, wykonując plamkę (lub niewielką rozmaz) bakterii za pomocą sterylizowanej płomieniowo pętli. Pętla jest sterylizowana po każdej inokulacji.

11. Zaszczepione płytki inkubuje się w pozycji odwróconej, z góry do dołu, w temperaturze 37 ° C przez 24 do 48 godzin w inkubatorze, aż do pojawienia się kolonii bakterii.

12. Płyty są zalewane roztworem jodu Lugola.