Krioprezerwacja gamet w rybach
W tym artykule omówimy krioprezerwację gamet w rybach.
Krioprezerwacja jest techniką przechowywania praktycznie bez ograniczeń czasowych. Zachowanie gamet ryb zostało wypróbowane za pomocą tej techniki. Krioprezerwacja plemników jest dobrze ugruntowaną procedurą w hodowli zwierząt.
Teraz kriokonserwowane plemniki są z powodzeniem stosowane do zapładniania bydła, koni, świń, owiec i drobiu. Warto zauważyć, że podjęto ogromne wysiłki, aby przenieść tę technologię do ochrony plemników, komórek jajowych i zarodków ryb.
Ta technika pomoże hodowcom ryb w następujący sposób:
(1) Problem braku koincydencji dojrzewania płci męskiej i żeńskiej może przezwyciężyć, jeśli plemniki lub komórki jajowe są przechowywane w magazynie.
(2) Można podjąć program selektywnej hodowli, który poprawi stan inwentarza rodzimego i pomoże trzeciemu światu w rozmnażaniu swoich rodzimych gatunków i wytwarzaniu specjalnych szczepów najwyższej łodygi.
(3) Technika kriokonserwacji gamet będzie odgrywać ważną rolę w zachowaniu rodzimych zasobów genowych, ponieważ wiele rdzennych ryb indyjskich nie może konkurować z egzotycznymi rybami. Dzięki tej technice gamety z zagrożonych gatunków są bankowane jako zabezpieczenie przed kurczącą się zmiennością genetyczną spowodowaną zaburzeniami środowiskowymi.
(4) Może pomóc w produkcji kultury mono-sex.
(5) Jeśli gametom można skutecznie zachowywać, możemy rozwijać ryby przez cały rok zgodnie z naszymi wymaganiami i możemy pomóc w tworzeniu banku genów, aby zachować oryginalność genetyczną populacji i utrzymać ją do ponownego wprowadzenia, gdy poprawią się ogólne warunki przetrwania.
Plemniki, jaja i zarodki można krioprezerwować, ale zachowanie jaj i zarodków jest trudne ze względu na niedostępność krioprotektanta, który jest wystarczająco absorbowany w tych komórkach ze względu na ich duży rozmiar w porównaniu z plemnikami.
Kriokonserwacja plemników u ryb jest skuteczna u ludzi; gatunki Gatunki te to Oncorhynchus, Salmo, Salvilinus fontinalis, Hucho hucho, Thymallus thymallus, Esox lucius i Cyprinus carpio, Serothodon mossambicus; Labeo rohita, Catla catla i Cirrhinus mrigala.
W zachowaniu plemników należy przestrzegać następujących kroków:
(1) Zbieranie miltu (nasienia).
(2) Przygotowanie roztworu wypełniacza.
(3) Wybór krioprotektanta.
(4) Zamrażanie.
(5) Sukces w nawożeniu.
Zbiór mil:
Pierwszym krokiem jest zebranie plemników. Zwykle plemniki są zbierane od zdrowych ryb metodą strippingu. Można użyć cewnika, który jest lepszą alternatywą dla usuwania. Wyselekcjonowano mysie potomstwo z najlepszymi charakterystycznymi cechami i przemywano roztworem Ringersa, a region brodawki narządów płciowych suszono.
Wylęg może być znieczulony lub znieczulony. Zazwyczaj stosuje się znieczulenie 0, 3 ml / l fenoksyetanolu. Według Kumara (1989), wstrzyknięcie sustonu 250 (organon) przed usunięciem placków daje lepszy efekt w karpiach indyjskich. Większość pracowników w tej dziedzinie zalecała bezzębne ryby do zdzierania w celu uzyskania milta.
Mleczka zbiera się w strzykawkach lub probówkach do hemolizy, a następnie przechowuje w szklanych ampułkach (zamkniętych lub nieuszczelnionych), plastikowych słomkach i często w plastikowych torebkach. Należy zwrócić uwagę na kolor, objętość, gęstość, pH i ruchliwość plemników.
Próbka powinna być wolna od moczu i kału. Rozmaz próbki należy zbadać pod mikroskopem, aby zauważyć nieprawidłowości w plemnikach. Jeśli próbka jest w porządku, należy ją poddać dalszemu przetwarzaniu, w przeciwnym razie można pobrać świeżą próbkę z nowych krasnali.
W okresie zbierania i przechowywania plemników strzykawka / ampułki / słoma mogą być trzymane w wodzie stawowej, aby utrzymać stałą temperaturę. Legendary i Billard (1980) zebrali plemniki w probówkach do hemolizy w topniejącym lodzie, a następnie przechowywali na chłodzonej powierzchni w temperaturze 4 ° C.
Przygotowanie i wybór rozcieńczalnika, rozwiązania, w którym zbierany jest mlot, ma kluczowe znaczenie dla kriokonserwacji. Wypełniacz zapobiega wyczerpaniu energii nasienia i utrzymuje plemniki w stanie spoczynku, ale żyje.
Istnieją dwa podstawowe przedłużacze. Nazywa się je Mounibs medium (M) i medium Menezo (Me). W tych dwóch środkach dodaje się białkową surowicę bydlęcą (BSA) i tellurowe żółtko jaja. W przypadku ryb indyjskich próbowano kilku przedłużaczy, modyfikując ich następujące składniki.
Typowymi składnikami są chlorek sodu, KCl, CaCl2, NaHCO3, Na2HPO4 i MgSO4. Oprócz tego dodawane są również składniki odżywcze i glicyna, aby poprawić kriokonserwację. Antybiotyki, takie jak gentomycyna lub streptomycyna są również dodawane do roztworu rozcieńczalnika, jeśli to konieczne.
Krioprotektant:
Główną funkcją krioprotektanta jest przenikanie do komórki i może pomagać plemnikom w tolerowaniu temperatury zamarzania. Najważniejszym i powszechnie stosowanym jest DSMO (dimetylosulfotlenek) i glicerol. Harvey (1983) używał metanolu, DSMO i glicerolu w połączeniu z mlekiem w proszku lub żółtkiem jaja.
Roztwór krioprotektanta i rozcieńczalnika w ustalonym stosunku, ogólnie jedna część krioprotektanta i dziewięć części roztworu rozcieńczalnika jest znany jako rozcieńczalnik. W tym rozcieńczalniku plemniki są zbierane do dalszego przetwarzania w celu zamrożenia.
Rozcieńczalnik (krioprotektant + rozcieńczalnik + plemniki) jest pobierany w słomkach poliwinylowych, a oba końce słomek są szczelnie zamknięte i gotowe do zamrożenia lub schłodzenia. Mlecz można schłodzić, temperaturę utrzymuje się w zakresie 0-5 oC. Podczas zamrażania stosuje się CO2 i ciekły azot Schłodzone przechowywanie przesianiu (0-50 o C) zostało szeroko przebadane w Salmonidach.
Podczas zamrażania należy kontrolować wiele problemów, takich jak wstrząs zimny, tworzenie się lodu wewnątrzkomórkowego i wstrząs osmotyczny. Kriokonserwacja oznacza ogólnie przechowywanie komórek lub tkanki w temperaturze -196 o C, temperatura ciekłego azotu (ryc. 22.1).
Uszkodzenie ciała powinno być kontrolowane. Zwykle występują trzy typy obrażeń komórek. Pierwszym z nich jest zimny wstrząs, który jest spowodowany przez schłodzenie powyżej temperatur ujemnych. Jest to ważniejsze dla komórek jajowych, niezbyt ważne dla plemników.
Występuje to do 0 ° C. Gdy temperatura wzrasta od 0 ° C do -80 ° C następuje szok osmotyczny i tworzenie lodu wewnątrzkomórkowego w komórkach jajowych i plemnikach. Dla pomyślnej kriokonserwacji te rzeczy są kontrolowane.
Krótko mówiąc, słomki zawierające rozcieńczalnik są przenoszone do kanistrów. Kanistry utrzymujące słomki po umożliwieniu zmiennego okresu równoważenia są najpierw zanurzane w oparach ciekłego azotu, a następnie w ciekłym azocie w temperaturze -196 ° C. Legendra i Billard (1980) przechowywali plemniki pstrągów tęczowych w suchym lodzie (stały CO2 -79 ° C) lub w ciekłym azocie do 6 miesięcy.
W wielu gatunkach słodkiej wody przeprowadzono zamrażanie za pomocą granulacji, zawieszające plemniki w suchy lód. Przejście od 0 ° C do -70 ° C trwa około 2 minut, co daje szybkość 35 ° C / min. Ponieważ szybkość spada powyżej - 60 ° C. Najlepsze wyniki uzyskuje się w ciekłym azocie.
Rozmrażanie:
Rozmrażanie jest odwrotnym zjawiskiem zamarzania. Rozmrażanie odbywa się w kąpieli wodnej w temperaturze od 10 ° C do 60 ° C. Powodzenie całej procedury zależy od ruchliwości plemników i zdolności do zapładniania komórek jajowych.
Stoss and Holtz (1982) zwiększyli ruchliwość plemników różowego łososia od 30 sekund do 10 minut, aktywując 120 nm roztworem NaHCO3, do którego dodano 1 BMX (3-izobutylo-1-metylo-ksantium). Kumar (1989) stwierdził, że długość okresu przechowywania wynosi około 20 dni w L. rohita i H. molitrix w warunkach kriogenicznych.
Jaja Salmo gairdeneri, Onchorhynchus kisutch i O.keta zostały utrwalone poprzez usunięcie w procesie odpędzania i zapieczętowania w plastikowych torebkach razem z płynem koelomicznym i utrzymywaniem pod tlenem w temperaturze 1 ° C. Następnie jaja mogą się rozprzestrzeniać, tworząc warstwę o głębokości jednego lub dwóch jaj.
Jajka następnie zmieszano z roztworem rozcieńczalnika i krioprotektantem prawie w podobny sposób jak opisano wcześniej dla plemników. Według Harveya i Kelleya (1984) niezamrożone (schłodzone) przechowywanie komórek jajowych było umiarkowanie skuteczne u łososiaków, a czas przechowywania w ciągu kilku tygodni uzyskano przez schłodzenie utlenionych jaj w płynie koelomicznym.
