Eksperyment do barwienia bakterii metodą Grama (z rysunkiem)

Przeczytaj ten artykuł, aby dowiedzieć się więcej o eksperymencie, aby przeprowadzić barwienie bakterii w celu wykrycia, czy jest to gram-dodatni czy gram-ujemny!

Cel, powód:

Najważniejszym barwieniem różnicowym stosowanym w mikrobiologii jest barwienie gramowe.

Jego nazwa pochodzi od dr. Christiana Grama, który podzielił bakterie na podstawie różnic w składzie ich ściany komórkowej na dwie grupy w następujący sposób:

(1) Bakterie Gram-dodatnie:

Po zabarwieniu bakterii fioletem krystalicznym, jeżeli ściana komórkowa jest odporna na odbarwianie przez przemywanie środkiem odbarwiającym (etanolem lub acetonem), jest to bakteria gram-dodatnia. Przykłady: Bacillus, Staphylococcus.

(2) Bakterie Gram-ujemne:

Po zabarwieniu bakterii fioletem krystalicznym, jeśli jego ściana komórkowa pozwala na odbarwienie przez przemywanie środkiem odbarwiającym (etanolem lub acetonem), jest to bakteria gram-ujemna. Przykłady: Escherichia, Salmonella, Vibrio.

Różnicowanie bakterii do grup Gram-dodatnich i Gram-ujemnych dostarcza najważniejszej wskazówki do dalszych działań w kierunku identyfikacji nieznanych bakterii. Jest również przydatny do prostego różnicowania bakterii do grup Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Daje również wyobrażenie o kształcie i rozmieszczeniu komórek bakterii.

Zasada:

W przypadku barwienia w gramach komórki bakterii najpierw wybarwiono pierwotnym barwnikiem, fioletem krystalicznym, który wchodzi do komórek i plami je na fioletowo-niebieski kolor. Następnie komórki traktuje się zaprawą, gramowym jodem, który wchodzi do komórek i wiąże się z pierwotnym wybarwianiem tworząc nierozpuszczalny kompleks barwnikowo-barwnikowy (krystaliczny kompleks jodowo-jodowy), utrudniając w ten sposób ucieczkę plamy.

Następnie komórki traktuje się środkiem odbarwiającym, takim jak etanol lub aceton. Działa jako rozpuszczalnik lipidowy i jako czynnik odwadniający białko. W komórkach Gram-dodatnich środek odbarwiający działa początkowo jako rozpuszczalnik lipidowy, rozpuszczając niewielką ilość lipidu obecnego w ścianie komórkowej, tworząc w ten sposób minimalne pory. Następnie odwadnia białka (peptydy) ściany komórkowej, które zamykają pory.

Teraz, środek barwiący jest trudny do usunięcia przez środek odbarwiający, a komórki zachowują purpurowo-niebieski kolor pierwotnego zabarwienia. W przypadku zabarwienia kontrastowego różowoczerwoną plamą, safraniny, nie może ona wejść do komórek, ponieważ pory zostały zamknięte.

Komórki ostatecznie zachowują purpurowo-niebieski kolor pierwotnego zabarwienia. Z drugiej strony, gram-ujemna ściana komórkowa zawiera dużą ilość lipidu (LPS), który jest rozpuszczany przez środek odbarwiający, co powoduje powstawanie dużych porów. Te pory nie zamykają się znacząco na odwadnianie białek ściany komórkowej.

Dlatego; kompleks bejcy barwiący ucieka przez pory, gdy zostaje umyta przez środek odbarwiający, a komórki stają się bezbarwne. Po zabarwieniu kontrastowym przez safraninę wchodzi on do komórek przez pory i ostatecznie komórki biorą różowoczerwony kolor przeciw plamie.

Wymagane materiały:

Slajd, pętla, wybarwienie pierwotne (fiolet krystaliczny), zaprawa (gram jodu), środek odbarwiający (95% etanol), przeciwblokada (safranina), hodowla bulion / skos / płytka bakterii, mikroskop, olej immersyjny.

Procedura:

1. Slajd jest prawidłowo czyszczony pod bieżącą wodą, tak aby woda nie pozostała jak krople na jego powierzchni (Rysunek 5.11).

2. Przylegającą wodę ściera się papierem z bibuły i suszy się na powietrzu.

3. Smużę bakterii przygotowuje się w środku szkiełka na dwie metody w następujący sposób.

(za) Jeśli obserwuje się bakterię hodowaną na płytce agarowej lub skos agarowy, kroplę wody umieszcza się pośrodku szkiełka i pętlę bakterii z płytki lub skosu przenosi się do niej za pomocą pętli wysterylizowanej nad płomieniem. Następnie, przez powolne obracanie się pętli w kropli, wytwarza się zawiesinę bakteryjną i rozprzestrzenia się aż do uzyskania rozmazu.

(b) Jeśli obserwuje się bakterię hodowaną w płynnym bulionie, kroplę zawiesiny bakterii umieszcza się bezpośrednio pośrodku szkiełka za pomocą sterylizowanej płomieniowo pętli i rozmazuje się przez rozprowadzenie.

4. Rozmaz suszy się powietrzem.

5. Rozmaz jest ustalany przez ogrzewanie. Ogrzewanie powoduje koagulację białek komórkowych, dzięki czemu komórki przyklejają się do powierzchni ślizgowej i nie zmywają się podczas barwienia. Utrwalanie cieplne wykonuje się przez szybkie przejście suwaka wysoko ponad płomień 2-3 razy, z rozmazem powierzchnia skierowana do góry, aby rozmaz nie został rozgrzany.

6. Poślizg utrzymuje się na tacy do barwienia i zalewa pierwszą barwą, fioletem krystalicznym, przez 1 minutę.

7. Nadmiar plamy zmywa się z rozmazu pod delikatnie płynącą wodą z kranu, w taki sposób, że woda nie spada bezpośrednio na rozmaz.

8. Rozmaz zalewa się zaprawą, jodem grama, przez 1 minutę.

9. Nadmiar zaprawy zostaje zmyta z rozmazu pod delikatnie płynącą wodą wodociągową, w taki sposób, że woda nie spada bezpośrednio na rozmaz.

10. Rozmaz jest zalewany środkiem odbarwiającym, 95% etanolem, przez 5 sekund, uważając, aby rozmaz nie był nadmiernie odbarwiony.

11. Etanol szybko zmywa się z rozmazu pod delikatnie płynącą wodą wodociągową, aby zapobiec nadmiernemu odbarwieniu. Uważa się, aby woda nie padała bezpośrednio na rozmaz.

12. Rozmaz zalewa się odplamiaczem, safraniną, przez 1 minutę.

13. Nadmiar plam przeciwprądowych jest wymywany z rozmazu pod delikatnie płynącą wodą z kranu, w taki sposób, że woda nie spada bezpośrednio na rozmaz.

14. Slajd wysuszyć na bibułę papierem bibułowym.

15. Slajd jest przytwierdzony do stopnia mikroskopu, a rozmaz obserwowany przy niskiej mocy i wysokich suchych celach.

16. Na smugę nakłada się kroplę oleju immersyjnego.

17. Smużę obserwuje się przy obiektywnym zanurzeniu w oleju.