Staraj się izolować różne bakterie obecne w danej próbce i utrzymuj czyste kultury

Celem jest wyodrębnienie różnych bakterii obecnych w danej próbce i zachowanie ich czystych kultur.

Cel, powód:

Bakterie występujące w przyrodzie nie występują jako gatunki posegregowane, występują raczej jako mieszane populacje różnych gatunków.

Dlatego, aby zbadać poszczególne gatunki bakterii, najpierw trzeba je oddzielić od mieszanej populacji. Proces ten nazywa się "izolacją bakterii".

Osiąga się to poprzez hodowanie mieszanej populacji bakterii na powierzchni stałego podłoża w odrębnych koloniach. "Kolonie" to pojedyncze, makroskopowo widoczne masy bakterii wyhodowanych na powierzchni stałego podłoża, z których każdy reprezentuje namnożenie pojedynczej bakterii.

Ponieważ każda kolonia pochodzi ze wzrostu i wielokrotnego namnażania pojedynczej bakterii, wszystkie bakterie obecne w kolonii należą do tego samego gatunku. Zatem każda kolonia reprezentuje bardzo dużą populację pojedynczego gatunku bakterii.

Kolonie te są przenoszone w warunkach aseptycznych w celu oddzielenia skosów z pożywki agarowej i pozostawienia tam do wzrostu. Izolowane gatunki bakterii, hodowane osobno na skosach agarowych, nazywane są "czystymi kulturami". Co 15-30 dni są przenoszone na świeże skosy, aby nie utraciły swojej pierwotnej charakterystyki z powodu przeludnienia, braku składników odżywczych i gromadzenia się metabolitów.

W ten sposób czyste kultury bakterii są utrzymywane w laboratorium przez powtarzane przenoszenie do świeżych skosów w regularnych odstępach czasu. Ten proces jest znany jako "utrzymanie czystej kultury". Czyste kultury są utrzymywane w laboratorium do ich późniejszej identyfikacji za pomocą różnych technik barwienia, biochemicznych, serologicznych i molekularnych, a także do ich przyszłego zastosowania.

"Kultury podstawowe" są standardowymi czystymi kulturami, których identyfikacja została ustalona na poziomie międzynarodowym dla rodzaju, gatunku, podgatunku, typu lub podtypu. Są one utrzymywane w uznanych na całym świecie laboratoriach mikrobiologicznych.

Inne laboratoria mogą je uzyskać z tych laboratoriów i utrzymywać w swoich laboratoriach jako hodowle macierzyste, powtarzając transfer do świeżych skosów w regularnych odstępach czasu. Służą one do potwierdzonej identyfikacji czystych kultur uzyskanych w tych laboratoriach, porównując ich charakterystyki ze standardowymi hodowlami podstawowymi.

Zasada:

Mieszana populacja bakterii obecnych w danym materiale (stałym, płynnym lub powierzchniowym) jest hodowana na odżywczych płytkach agarowych za pomocą rozłożonej płytki lub metody pasmowej, jak opisano wcześniej w "Uprawa bakterii". Każda wyizolowana kolonia znaleziona na płytce agarowej składa się z jednego gatunku bakterii, ponieważ każda kolonia wyrasta z pojedynczej bakterii.

Tak więc, bakterie są izolowane na płytkach agarowych za pomocą dwóch technik, jak następuje:

(a) Technika nakładania płytek

(b) Technika płytki smugowej

Reprezentatywne kolonie (kolonie o odmiennych cechach) wybiera się i aseptycznie inokuluje w celu oddzielenia skosów agarowych w celu uzyskania czystych kultur. Po każdych 15 do 30 dniach są przenoszone na świeże skosy w celu utrzymania tych czystych kultur.

Wymagane materiały:

Probówki (5 nos), kolba stożkowa o pojemności 250 ml (1 nie), 0, 1 N NaOH, 0, 1 N HCl, woda destylowana, agar odżywczy, niewchłaniająca się bawełna, pętelka, papier ścierny, nić (lub gumka), papier pH (lub pH-metr), palnik Bunsena, autoklaw, komorę laminarną, inkubator, płytki zawierające izolowane kolonie bakterii (płyta rozsiewająca lub płyta smugowa).

Procedura:

1. Składniki pożywki agarowej lub jej gotowy proszek wymagany do napełnienia 100 ml pożywki waży się i rozpuszcza w 100 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml przez wstrząsanie i wirowanie (rysunek 6.4).

2. Jego pH określa się przy użyciu papieru lub pH-metru pH i doprowadza się do 7, 0 za pomocą 0, 1N HCl, jeśli jest on większy lub stosuje 0, 1 N NaOH, jeśli jest on mniejszy.

3. Kolbę ogrzewa się w celu całkowitego rozpuszczenia agaru w podłożu.

4. Zanim się zestali, podłoże w stanie ciepłym stopionym rozdziela się na 5 probówek (w przybliżeniu po 20 ml).

5. Probówki są z bawełny, pokryte papierem ściernym i związane nicią lub gumką.

6. Są sterylizowane w 121 ° C (ciśnienie 15 psi) przez 15 minut w autoklawie.

7. Po sterylizacji są one usuwane z autoklawu i utrzymywane w pozycji pochylonej w celu schłodzenia i zestalenia ośrodka. Te probówki zawierające zestalone pożywki agarowe w stanie skośnym są nazywane "skosami po agarze odżywczym".

8. Etapy 10 i 11 należy wykonywać w warunkach aseptycznych, najlepiej w komorze laminarnej. Otwór pojemników zawierających jałową pożywkę lub kulturę należy pokazać nad płomieniem palnika Bunsena po zdjęciu bawełnianej zatyczki i przed ponownym założeniem.

Pętle, przed użyciem, należy wysterylizować nad płomieniem, ogrzewając je do gorącej czerwieni, a następnie schładzając przez 30 sekund w celu schłodzenia do temperatury pokojowej. Nigdy nie powinny być używane, gdy są bardzo gorące, ponieważ zabijają mikroby podczas ich dotykania.

9. W poprzednim doświadczeniu, jeśli można zaobserwować wyizolowane kolonie na płycie rozsiewającej lub blasze smugowej, pięć kolonii o odmiennych właściwościach wybrano jako reprezentatywne kolonie.

10. Pętla sterylizowana jest nad płomieniem, a pętla bakterii z każdej reprezentatywnej kolonii jest pobierana w warunkach aseptycznych. Pętla jest wprowadzana do skosu agaru, tak że pętla bakterii przechodzi do końca skosu. Pętla jest przemieszczana na zewnątrz w sposób falisty, dotykając powierzchni nachylenia, tak że powstaje falista linia.

11. Pętla jest sterylizowana płomieniem i w podobny sposób reszta z czterech reprezentatywnych kolonii inokulowana jest osobno w lewo nad czterema skosami. Pętla jest sterylizowana po każdej inokulacji.

12. Pięć zaszczepionych skosów inkubuje się w temperaturze 37 ° C przez 24 godziny w inkubatorze.

Obserwacje (charakterystyka kulturalna):

(i) Obserwowana falista linia ze wzrostem wzdłuż długości

Wzrost miał miejsce.

Skos jest obserwowany dla charakterystyki ukośnej w następujący sposób (rysunek 6.5).

1. Obfitość wzrostu:

Ilość wzrostu określa się jako brak, niewielki, umiarkowany lub duży.

2. Pigmentacja:

Chromogenne mikroorganizmy mogą wytwarzać wewnątrzkomórkowe pigmenty odpowiedzialne za zabarwienie organizmu widoczne w koloniach powierzchniowych. Inne organizmy wytwarzają pozakomórkowe rozpuszczalne pigmenty, które są wydalane do pożywki, a także wytwarzają kolor. Większość organizmów nie jest jednak chromomerycznych i będzie wyglądała od białej do szarej.

3. Charakterystyka optyczna:

Charakterystyki optyczne można oceniać na podstawie ilości światła przepuszczanego przez wzrost.

Te cechy są opisane jako:

(za) Nieprzezroczyste: brak transmisji światła.

(b) Translucent: Częściowa transmisja światła.

(do) Transparentny: pełna transmisja światła.

4. Forma:

Pojawienie się pojedynczej linii smugi wzrostu na powierzchni agaru jest oznaczone następująco:

(za) Filiform: Ciągły, nitkowaty wzrost z gładkimi krawędziami.

(b) Echinulate: ciągły, nitkowaty wzrost z nieregularnymi krawędziami.

(do) Zroszony: niekonfliktowe lub częściowo konfluentne kolonie.

(re) Efekt: Cienki, rozprzestrzeniający się wzrost.

(mi) Arborescent: Wzrost drzewopodobny.

(f) Rhizoid: wzrost podobny do roota.

(ii) Brak wzrostu wzdłuż linii inokulacji:

Wadliwa technika inokulacji, Inokulacja jest powtarzana C Wyliczenie bakterii.

C. Wyliczanie bakterii:

Stopień aktywności bakterii w danej próbce w określonym zestawie warunków zależy głównie od całkowitej liczby bakterii w niej obecnych, niezależnie od ich gatunku. Dlatego bardzo często konieczne jest ustalenie całkowitej liczby bakterii obecnych w próbkach żywności, wody, gleby, powietrza i tkanki podczas ich analizy mikrobiologicznej.

Oszacowanie liczby bakterii w danej próbce nazywa się "wyliczeniem bakterii". Istnieją różne metody oznaczania bakterii podane poniżej. Wszystkie te metody wymagają obecności bakterii w homogennej zawiesinie.

Dlatego zakłada się, że próbki płynne są homogennymi zawiesinami bakterii i są bezpośrednio stosowane, podczas gdy próbki stałe są homogenizowane w sterylnych roztworach soli fizjologicznej, aby uzyskać jednorodne zawiesiny bakterii.

Nie używane powszechnie:

(I) Metody bezpośrednie:

(a) Bezpośrednia liczba mikroskopowa

(b) Elektroniczny licznik komórek

(II) Metody pośrednie:

(re) Metoda turbidymetryczna

(mi) Liczba filtrów membranowych

Najszerzej stosowane:

(f) Metoda seryjnego rozcieńczania-agarowego powlekania lub metoda całkowitego zliczania płytek (metoda TPC)

(a) Bezpośrednia mikroskopijna liczba:

W tej metodzie liczba bakterii obecnych w porcji homogennej zawiesiny bakterii jest liczona bezpośrednio pod mikroskopem, a ogólna liczba bakterii w próbce jest określana matematycznie.

Zaletą tej metody jest to, że jest bardzo szybka. Wady polegają na tym, że zarówno żywe (żywe), jak i martwe komórki są zliczane, a metoda nie jest wrażliwa na populacje o wielkości poniżej miliona bakterii na mililitr.

Zliczanie można wykonać na dwa sposoby w następujący sposób:

(i) Petroff-Hauser Chamber:

Jest to wyspecjalizowana komora do zliczania, w której podwielokrotność homogennej zawiesiny bakterii jest umieszczana w celu zliczania bezpośrednio pod mikroskopem.

(ii) Rozmaz w rasie:

Komórki bakterii są policzone bezpośrednio pod mikroskopem przy użyciu barwionych rozmazów zamkniętych na powierzchni 1 mm2 na szkiełku. Jest używany głównie do liczenia bakterii w mleku.

(b) Elektroniczny licznik komórek:

Elektroniczny licznik komórek, taki jak "Licznik Coultera", służy do bezpośredniego policzenia liczby komórek bakterii. Jednorodną zawiesinę komórek bakterii wytworzonych w przewodzącym płynie przepuszcza się przez mały otwór, przez który przepływa prąd elektryczny.

Opór przy otworze jest rejestrowany elektronicznie. Kiedy komórka przechodzi przez otwór, będąc nieprzewodnikiem, chwilowo zwiększa opór. Liczba chwilowych wzrostów oporu jest rejestrowana elektronicznie, co wskazuje na liczbę bakterii obecnych w zawiesinie.

Zaletą tej metody jest to, że jest ona niezwykle szybka. Wady polegają na tym, że zarówno żywe (żywe), jak i martwe komórki są zliczane, a przyrząd nie może odróżnić komórek bakteryjnych od obojętnych cząstek stałych.

(c) Metody chemiczne:

Metody te szacują ilość tych substancji, głównie chemikaliów, które zwiększają się wraz ze wzrostem populacji bakterii.

Główne szacowane parametry są następujące:

(i) Stężenie białka

(ii) stężenie DNA

(iii) Sucha masa

(iv) Wytwarzanie dwutlenku węgla

(v) Pobieranie tlenu

(vi) Produkcja kwasu mlekowego

(d) Metoda turbidymetryczna:

Gdy bakterie są hodowane w ciekłych pożywkach bogatych w składniki odżywcze (np. Pożywki), ich obfity wzrost powoduje, że media stają się mętne, ponieważ komórki bakterii pozostają w nich w większości zawieszone. Zmętnienie wzrasta wraz ze wzrostem liczby komórek w ośrodku. Wraz ze wzrostem zmętnienia zwiększa się "absorbancja" lub "gęstość optyczna (OD)" ośrodka.

OD zawiesiny komórek bakterii w pożywce mierzy się za pomocą spektrofotometru przy długości fali 600 nm. Liczba komórek bakterii w zawiesinie została ustalona przez porównanie OD z krzywą standardową przygotowaną przez wykreślenie wartości OD dla różnych znanych stężeń bakterii. Metoda jest szybka, ale ogranicza się do zawiesin bakteryjnych ponad 10 milionów komórek.

(e) Liczba filtrów membranowych:

Ta metoda jest stosowana, gdy liczba bakterii w próbce cieczy jest bardzo mniejsza. Aby zwiększyć stężenie bakterii, najpierw próbkę cieczy filtruje się aseptycznie przez sterylizowany aparat z filtrem membranowym, stosując sterylny filtr membranowy.

Filtr membranowy zawierający uwięzione bakterie przenosi się aseptycznie na sterylną szalkę Petriego zawierającą wkładkę absorpcyjną nasyconą selektywnym ciekłym ośrodkiem. Medium wycieka na powierzchnię filtra. Po inkubacji liczbę kolonii utworzonych na filtrze zlicza się za pomocą prostego mikroskopu.