Eksperyment do izolowania kolizji wirusa (z diagramem)

Eksperyment do izolowania kolizji wirusa!

Zasada:

Bakteriofag lub fag (wirus), który infekuje bakterie, Escherichia coli zwany jest kolipagerem (coli: E. coli, fag: bakteriofag).

Można go uzyskać z różnych źródeł naturalnych, takich jak gleba, fekalia i ścieki surowe. Jego izolacja z tych źródeł nie jest bardzo łatwa, ponieważ występuje w niskim stężeniu.

Dlatego też najpierw jego liczba jest zwiększana przez etap wzbogacania, w którym bogatą hodowlę bakterii gospodarza (tj. E. coli) dodaje się do próbki zawierającej kolombat i inkubuje. Kolifat infekuje E. coli i obficie zwiększa liczbę. Ta kultura bogata w colifage jest odwirowywana w celu osadzenia cząstek stałych.

Osad odrzuca się, a supernatant filtruje się przez filtr mikrobiologiczny w celu zatrzymania bakterii i innych cząstek, jednocześnie pozwalając na przejście koloshu. Filtrat, bogaty w kolipage, jest używany do zaszczepienia zawiesiny E. coli, która następnie może rosnąć jako konfluentny trawnik na płytce z agarem.

Koluzja rozwija się w komórkach E. coli i poddaje je lizie. Liza komórek bakteryjnych powoduje powstawanie wyraźnych stref na zlewnym trawniku bakterii. Te czyste strefy nazywane są tablicami. Zakłada się, że każda wolna strefa powstaje w wyniku pojedynczego kolipażu.

Wymagane materiały:

Pipety, kolby stożkowe, szalki Petriego, probówki, kołki bawełniane, palnik bunsena, saszetka utylizacyjna, wirówka, aparat do filtracji membranowej, komora laminarna, autoklaw, inkubator, bulion bakteriofagowy, agar tryptonowy, agar tryptonowy, pożywka bulionowa bakterie Escherichia coli (np. E. coli B), próbka (np. surowe ścieki).

Procedura:

1. Pięć pipet (w przypadku pipety ze stali nierdzewnej) i pięć szalek Petriego sterylizuje się w piecu z gorącym powietrzem w temperaturze 180 ° C przez 3 godziny. Ewentualnie można je pokryć papierem ściernym, związać nitką lub gumką i wysterylizować w autoklawie wraz z nośnikiem (Rysunek 8.5).

2. Odważa się składniki bulionu bakteriofagowego lub jego gotowego proszku, wymagane dla 100 ml pożywki, rozpuszcza się w 100 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml i doprowadza pH do 7, 6. Kolba jest z bawełny, pokryta papierem ściernym i przewiązana nicią lub gumką.

3. Odważa się składniki podłoża agarowego tryptonu lub jego gotowego proszku, wymagane dla 100 ml pożywki, rozpuszcza w 100 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml i doprowadza pH do 7, 5.

4. To ciekłe środowisko jest rozprowadzane w 5 probówkach (po 2 ml), waty bawełnianej, pokrytej papierem ściernym i związane nicią lub gumką.

5. Składniki pożywki agarowej tryptonowo-twardej lub jej gotowego proszku wymaganego dla 100 ml pożywki waży się i rozpuszcza w 100 ml wody destylowanej w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml, ogrzewając po dostosowaniu pH do 7, 5. Kolba jest z bawełny, pokryta papierem ściernym i przewiązana nicią lub gumką.

6. Kolba zawierająca bulion bakteriofagowy, probówki z miękkim agarem z tryptonem 5, kolba z agarem z tryptonem w twardym agarze i pusta kolba stożkowa o pojemności 250 ml z bawełnianą strzykawką sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 121 ° C (ciśnienie 15 psi) przez 15 minut.

7. Sterylizowany twardy agar tryptonowy w kolbie stożkowej wlewa się do 5 wyjałowionych szalek Petriego aseptycznie i pozostawia do ostygnięcia, tak aby uzyskać 5 płytek agarowych z tryptonem.

8. Do wysterylizowanej pustej kolby stożkowej o pojemności 250 ml z wkładką bawełnianą, 5 ml wysterylizowanego bulionu bakteriofagowego, 5 ml hodowli bulionowej E. coli B i 45 ml nieoczyszczonych ścieków przeniesiono aseptycznie, najlepiej w komorze z przepływem laminarnym (rysunek 8.6) .

9. Kolbę inkubuje się w temperaturze 37 ° C przez 24 godziny, aby umożliwić proliferację kolo- dażu w ściekach w komórkach bakterii gospodarza (komórki E. coli B).

10. Zawartość kolby przelano do 100 ml probówek wirówkowych i odwirowano przy 2500 obrotach na minutę przez 20 minut w wirówce, aby osadzić cząstki. Osad jest odrzucany.

11. Supernatant bogaty w kolipage jest filtrowany przez membranowy aparat filtracyjny. Pozostałość odrzucono.

12. Pięć wysterylizowanych miękkich agar tryptonu pobrano i ogrzewano na łaźni wodnej do temperatury 100 ° C, tak aby stopić agar. Probówki chłodzi się i utrzymuje w temperaturze 45 ° C na łaźni wodnej.

13. Używając sterylnej pipety, 1, 2, 3, 4 i 5 kropli filtratu wolnego od bakterii, bogaty w kolipage przenosi się aseptycznie na pięć probptonowych miękkich agarowych probówek.

14. Do każdej probówki z miękkim agarem tryptonu, 0, 1 ml pożywki bulionowej Escherichia coli B przenosi się aseptycznie.

15. Zawartość pięciu probówek typu soft agar tryptonu zawierających wirusa, kolypage i bakterie E. coli B miesza się szybko, obracając probówki między dłońmi.

16. Zawartość wylewa się na pięć płytek agarowych z tryptonem (oznaczone 1 do 5 kropli), tworząc w ten sposób dwuwarstwowy preparat do hodowli płytek. Płytki delikatnie wiruje się i pozostawia do stwardnienia.

17. Zaszczepione płytki inkubuje się w odwróconej pozycji w 37 ° C przez 24 godziny w inkubatorze.

Obserwacje:

1. Wszystkie płytki obserwuje się dla jednostek tworzących łysinki (PFU), które rozwijają się jako czyste strefy na trawniku bakterii. Tworzenie płytki nazębnej wskazuje na obecność kolo- fagów w hodowli.

2. Każda płytka reprezentuje bogaty wzrost izolowanego kolagażu.

3. Liczbę tabliczek zlicza się we wszystkich tablicach i tabelarycznie w następujący sposób (Tabela 8.1).

Tabela 8.1: Obserwacje liczby kolypów :