7 Techniki obserwacji obiektów za pomocą mikroskopów elektronowych
Niektóre z najważniejszych technik, które są stosowane do obserwacji obiektów pod mikroskopami elektronowymi, to: (1) Rzucanie cienia (2) Negatywne barwienie (3) Bardzo cienkie cięcie (4) Zamrażanie-trawienie (5) Lokalizacja składników komórkowych (6) Lokalizacja enzymów (7) Autoradiografia.
(1) Rzucanie cienia:
W przypadku odlewania w cieniu mikroskopijny obiekt jest suszony w specjalnej kratce umieszczonej wewnątrz słoika próżniowego.
Niezwykle cienka warstwa metalu (np. Platyny) osadza się na obiekcie z wysokoogrzewanego włókna pod kątem ukośnym, tak że przedmiot wytwarza cień na niepowlekanej stronie.
Badanie zacienionego obrazu dostarcza informacji o kształcie obiektu (cechy topograficzne powierzchni obiektu), które można zaobserwować za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego.
(2) Negatywne barwienie:
Technika ta jest stosowana do obserwacji drobnych szczegółów bardzo małych obiektów, takich jak wirusy i bakterie wici. Materiał nieprzezroczysty elektronom, taki jak kwas fosforowolframowy lub jego sól, pozwala na utworzenie powłoki o grubej osnowie na powierzchni przedmiotu, bez wchodzenia do niej. Kiedy elektrony z wyrzutni elektronowej mikroskopu elektronowego nie mogą przejść przez te powleczone powierzchnie, struktury te stają się wyraźnie widoczne.
(3) Bardzo cienkie cięcie:
Nienaruszona komórka drobnoustrojów jest zbyt gruba, aby umożliwić wizualizację jej wewnętrznych drobnych struktur pod mikroskopem elektronowym. W celu obserwacji wewnątrzkomórkowych drobnych struktur, komórka jest osadzona w bloku z tworzywa sztucznego i pocięta na ultracienkie sekcje (o grubości nawet 60 nm).
Dokładną strukturę interpretuje się, obserwując kilka ultracienkich plastrów podzielonych na różne poziomy i pod różnymi kątami. Poprawienie kontrastu struktur jest możliwe dzięki zastosowaniu specjalnych plam, takich jak sole uranu i lantanu.
(4) Freeze-trawienie:
Aby uzyskać ultracienkie sekcje obiektu, należy go naprawić za pomocą obróbki chemicznej. Takie traktowanie chemiczne skutkuje artefaktami. Te artefakty są przezwyciężane przez trawienie przez zamrażanie. W procesie liofilizacji próbka jest zamrażana wewnątrz bloku i jest dzielona na kawałki, pozostając w niej w stanie zamrożonym.
(5) Lokalizacja składników komórkowych:
Jest to specjalna technika przeprowadzana w celu zlokalizowania chemicznych składników komórek. Na przykład, aby zlokalizować antygen w komórce, ultracienka część komórki jest traktowana przeciwciałem wyznakowanym ferrytyną, która wiąże się z antygenem, tworząc kompleks przeciwciała z antygenem znakowany ferrytyną.
Ponieważ ferrytyna jest substancją zawierającą żelazo o dużej gęstości, kompleks przeciwciało-antygen znacząco wpływa na przechodzenie wiązki elektronów, tworząc w ten sposób wysoki kontrast dla wyraźnej obserwacji pod mikroskopem elektronowym.
(6) Lokalizacja enzymów:
Technika ta służy do lokalizacji pozycji enzymów w komórkach. Na przykład, przy wykryciu enzymu dehydrogenazy izocytrynianowej, przygotowuje się ultracienkie sekcje komórek bakterii. Następnie koloidalne złoto jest przymocowane swoiście do enzymu, zgodnie z techniką immunochemiczną. Koloidowy, utrwalony w złocie enzym można obserwować pod mikroskopem elektronowym.
(7) Autoradiografia:
Jest to technika cytochemiczna, w której określanie położenia określonego składnika chemicznego w obiekcie określa się, obserwując miejsce, w którym zostaje umieszczony materiał radioaktywny. Obiekt jest po raz pierwszy wystawiony na działanie substancji radioaktywnej, aby umożliwić jego pobieranie.
Następnie pokryto warstwą emulsji fotograficznej i trzymano w ciemności przez kilka godzin. Promieniowanie jonizujące emitowane podczas rozpadu substancji wytwarza utajone obrazy w emulsji. Po obróbce fotograficznej opracowane obrazy są widoczne pod mikroskopem elektronowym jako ziarna srebra w preparacie.
