Eksperyment na przeprowadzanie szybkiego barwienia bakterii

Eksperymentuj nad przeprowadzaniem kwaso-szybkiego barwienia bakterii, aby dowiedzieć się, czy jest odporny na działanie kwasów lub bez kwasu!

Cel, powód:

Większość bakterii może być wybarwiona albo przez proste barwienie podstawowe, albo przez barwienie, ponieważ ich komórki łatwo znoszą plamy.

Jednak niektóre bakterie mają grubą woskową ścianę komórkową wykonaną z materiałów lipidowych.

Takie bakterie są niezwykle trudne do wybarwienia, ponieważ zwykłe wodne plamy nie mogą łatwo dostać się do ich komórek, ale po zabarwieniu; równie trudno jest usunąć plamę z ich komórek, nawet przy energicznym stosowaniu kwaśnego alkoholu jako środka odbarwiającego. Te bakterie są zabarwione przez szybkie barwienie kwasem.

Tak więc, barwienie odporne na działanie kwasów, podobne do barwienia grama, jest metodą barwienia różnicowego, która różnicuje bakterie, w oparciu o naturę ich ściany komórkowej, na dwie grupy w następujący sposób:

(1) Bakterie szybko kwasowe:

Bakteria, która jest niezwykle trudna do wybarwienia, ale raz zabarwiona, równie trudno jest usunąć plamę z komórek, nawet przy intensywnym stosowaniu kwasu-alkoholu jako czynnika odbarwiającego, jest bakterią kwasowo-szybką (kwaśną) bakteria).

Przykłady: Mycobacterium spp. [M. gruźlica (bakterie TB), M. leprae (bakterie trądu), M. smegmatis (naturalna bakteria smegma) i M. marinum (bakterie TB ryb morskich). Mają grubą woskową ścianę komórkową wykonaną z materiałów lipidowych.

(2) Bakterie bezkwasowe:

Bakteria, która łatwo ulega zabarwieniu, a także łatwo odbarwia ją kwaśny alkohol jako środek odbarwiający, to bakteria bezkwasowa (bakterie bezkwasowe). Przykłady: Wszystkie bakterie z wyjątkiem Mycobacterium spp. W tych bakteriach ściana komórkowa nie jest gruba i woskowa.

Szybkie barwienie jest użyteczne w różnicowaniu bakterii odpornych na kwas i bez działania kwasów, a także w identyfikacji bakterii należących do rodzaju Mycobacterium.

Zasada:

Bakterie odporne na kwasy różnią się od bakterii nieagresywnych kwasowo tym, że posiadają grubą woskową ścianę komórkową wykonaną z materiałów lipidowych. Zwykłe wodne plamy, takie jak błękit metylenowy lub fiolet krystaliczny, nie mogą przedostać się do ich komórek przez tę woskową ścianę komórkową.

Jednakże barwiona na czerwono fuksyna pierwotna z barwionym kolorem fenolowym (kwas karbolowy lub fenol + fuksyna podstawowa); który jest rozpuszczalny w materiałach lipidowych ściany komórkowej, może wchodzić do ich komórek przez ścianę komórkową i może być zatrzymany wewnątrz komórek nadając im czerwony kolor.

Penetracja jest dodatkowo zwiększona przez zastosowanie ciepła, które napędza fuksynę karbolową przez ścianę lipidową do cytoplazmy. (Niewielka modyfikacja tej metody Ziel-Neelsena opisuje dodanie środka zwilżającego, Turgitolu, do barwienia, co zmniejsza napięcie powierzchniowe między ścianą komórki a plamą, a zatem nie wymaga ogrzewania). Komórki pozostawia się do ochłodzenia, aby utwardzić woskową ścianę komórkową.

Gdy komórki są eksponowane na środek odbarwiający, kwasowo-alkoholowy, są odporne na odbarwianie, ponieważ pierwotne zabarwienie jest bardziej rozpuszczalne w woskach komórkowych niż w odbarwianiu. Następnie, po wybarwieniu barwnikiem błękitu metylenowego, nie może przedostać się do komórek przez woskową ścianę komórkową.

Tak więc, bakterie szybko kwasiste zachowują czerwony kolor pierwotnego zabarwienia i wyglądają na czerwone. Z drugiej strony, bakterie bezkwasowe szybko przyjmują pierwotne zabrudzenia i łatwo ulegają odbarwieniu. Gdy są wybarwione kontrastowo błękitem metylenowym, te bezbarwne komórki łatwo pobierają przeciw-plamę i wydają się niebieskie, w przeciwieństwie do bakterii szybko kwaśnych, które wyglądają na czerwone.

Wymagane materiały:

Slajd, pętla, pierwotne zabarwienie (fuksyna z karbolu), środek odbarwiający (kwasowo-alkoholowy), kontrastowe zabarwienie (błękit metylenowy), gorąca płytka, hodowla bakterii z bulionem / płytką / płytką, mikroskop, olej immersyjny.

Procedura:

1. Slajd jest prawidłowo czyszczony pod bieżącą wodą, tak aby woda nie pozostała jak krople na jego powierzchni (Rysunek 5.12).

2. Przylegającą wodę ściera się papierem z bibuły i suszy się na powietrzu.

3. Smużę bakterii przygotowuje się w środku szkiełka na dwie metody w następujący sposób.

(a) Jeśli obserwuje się bakterie wyhodowane na płytce agarowej lub skos agarowy, kroplę wody umieszcza się pośrodku szkiełka i pętlę bakterii z płytki lub skosu przenosi się do niej za pomocą pętli wysterylizowanej nad płomieniem . Następnie, przez powolne obracanie się pętli w kropli, wytwarza się zawiesinę bakteryjną i rozprzestrzenia się aż do uzyskania rozmazu.

(b) Jeśli obserwuje się bakterie wyhodowane w ciekłym bulionie, kroplę zawiesiny bakterii umieszcza się bezpośrednio pośrodku szkiełka za pomocą sterylizowanej płomieniowo pętli i rozmazuje się przez rozprowadzanie.

4. Rozmaz suszy się powietrzem.

5. Rozmaz jest ustalany przez ogrzewanie. Ogrzewanie powoduje koagulację białek komórkowych, dzięki czemu komórki przyklejają się do powierzchni szkiełka i nie zmywają się podczas barwienia. Utrwalanie cieplne wykonuje się przez 2-3-krotne przesunięcie suwaka wysoko nad płomieniem, z powierzchnią rozmazu skierowaną do góry, tak aby rozmaz nie został rozgrzany.

6. Rozmaz jest zalewany fuksyną

7. Slajd umieszcza się na ciepłej gorącej płycie, pozwalając na przygotowanie pary przez 5 minut. Temperatura gorącej płyty jest tak ustawiona, że preparat się nie gotuje i szybko się odparowuje. Strata z parowania zostaje uzupełniona, aby rozmaz nie wyschnął. (W przypadku metody bez ogrzewania rozmaz zalewa się przez 3-5 minut fuksyną zawierającą Turgitol).

8. Slajd wyjmuje się z gorącej płyty i chłodzi.

9. Nadmiar plamy zmywa się z rozmazu pod delikatnie płynącą wodą z kranu, w taki sposób, że woda nie spada bezpośrednio na rozmaz.

10. Środek odbarwiający, kwasowo-alkoholowy, dodaje się do kropli po kropli, aż karbolowa fuksyna nie zmyje się z wymazu.

11. Kwasowy alkohol jest wymywany z rozmazu pod delikatnie płynącą wodą z kranu, w taki sposób, że woda nie spada bezpośrednio na rozmaz.

12. Rozmaz zalewa się plamą przeciwtlenkową, błękitu metylenowego, przez 2 minuty.

13. Nadmiar plam przeciwprądowych jest wymywany z rozmazu pod delikatnie płynącą wodą z kranu, w taki sposób, że woda nie spada bezpośrednio na rozmaz.

14. Slajd wysuszyć na bibułę papierem bibułowym.

15. Slajd jest przytwierdzony do stopnia mikroskopu, a rozmaz obserwowany przy niskiej mocy i wysokich suchych celach.

16. Na smugę nakłada się kroplę oleju immersyjnego.

17. Smużę obserwuje się przy obiektywnym zanurzeniu w oleju.