Replikacja DNA: mechanizmy replikacji DNA

Niektóre z najważniejszych trybów replikacji DNA są następujące!

Replikacja DNA w eukariotach jest semekonserwatywna, półciągła i dwukierunkowa w porównaniu z półkonserwatywną, dwukierunkową i ciągłą w organizmach prokariotycznych.

Zdjęcie dzięki uprzejmości: dbriers.com/tutorials/wp-content/uploads/2012/12/DNA_replication_split.png

Replikacja DNA zachodzi podczas fazy S cyklu komórkowego. Jest to wieloetapowy złożony proces, który wymaga kilkunastu enzymów i czynników białkowych. Rozpoczyna się w określonym miejscu zwanym początkiem replikacji lub ori. Bakteryjny i wirusowy DNA ma pojedyncze miejsce replikacji. Działa jako pojedyncza jednostka replikująca lub replikon.

W eukariotycznym DNA istnieje wiele początków replikacji. Ma kilka replikujących się segmentów lub replikonów, tj. Multirepliconic. W przypadku braku ori replikacja nie wystąpi. Wymaganie wektora dla technologii rekombinacji DNA polega na uzyskaniu początku replikacji.

Replikacja DNA jest energetycznie wysoce kosztowna. Głównym enzymem replikacji DNA jest polimeraza DNA zależna od DNA. Replikacja DNA jest dość szybka. Replikacja DNA E. coli przy 4, 6 x 10 ⁶ pz wymaga 19 minut.

Średnia szybkość polimeryzacji zasad wynosi 2000 pz na sekundę w każdym kierunku. Replikacja wymaga obfitej energii pochodzącej z rozkładu trifosforanów deoksyrybonukleotydów.

Replikacja odbywa się w następujący sposób:

1. Aktywacja dezoksyrybonukleotydów:

Dezoksyrybonukleotydy lub monofosforany deoksyrybonukleozydów występują swobodnie wewnątrz nukleoplazmy. Są to cztery typy - deAMP (monofosforan deoksyadenozyny), deGMP (monofosforan deoksyguanozyny), deCMP (monofosforan deoksycytydyny) i deTMP (monofosforan deoksytymidyny). Są one najpierw sfosforylowane i zamienione na formy aktywne, które mają trzy reszty fosforanowe zamiast jednego. Wymagana jest fosforylaza enzymów wraz z energią.

Do fosforylowanych nukleotydów należą deATP (trifosforan deoksyadenozyny), deGTP (trifosforan deoksyguanozyny), deCTP (trifosforan deoksycytydyny) i deTTP (trifosforan deoksytymidyny). Te trifosforany zasad służą podwójnemu celowi. Działają one jak substrat, a także zapewniają energię do polimeryzacji nukleotydów.

2. Ekspozycja nici DNA:

Helicaza enzymatyczna (unwindaza) działa w miejscu Ori i rozpina (rozwija) dwie nici DNA, niszcząc wiązania wodorowe. Oddzielone pasma są stabilizowane za pomocą jednoniciowych białek wiążących (SS BP) lub białek stabilizujących helisę. Rozwijanie tworzy naprężenie w rozwiniętej części poprzez tworzenie większej liczby superskrętów. Napięcie jest uwalniane przez enzymy topoizomeraz.

Powodują odcięcie i ponowne zamknięcie nici DNA. Wraz z topoizomerazą bakterie posiadają inny enzym zwany gyrazą DNA, który może wprowadzać ujemne superziele (starsi pracownicy wierzyli, że gyra działa zarówno na helikazę jak i topoizomerazę).

Za pomocą różnych enzymów obie nici DNA stają się otwarte do replikacji. Jednak cały DNA nie otwiera się w jednym odcinku ze względu na bardzo wysokie zapotrzebowanie na energię. Punkt separacji postępuje powoli w kierunku obu kierunków. W każdym kierunku daje wygląd struktury w kształcie litery Y zwanej widełką replikacyjną (Rys. 6.13 i 6.14).

3. RNA Primer:

Jest to niezbędne do inicjacji nowych łańcuchów DNA. Primer RNA to mała nić RNA syntetyzowana na końcu 5 'nowej nici DNA za pomocą specyficznego dla DNA enzymu polimerazy RNA zwanego primase. Primer RNA powstaje na wolnym końcu jednej nici i końca widełek drugiej nici. Tworzenie primerów RNA stanowi fazę inicjacji syntezy DNA, ponieważ bez obecności primera RNA, polimerazy DNA nie mogą dodawać nukleotydów.

Bardziej złożony enzym zwany primo some jest wymagany w fagu ф x 174 i niektórych innych układach prokariotycznych. W eukariotach funkcję primazy prowadzi się za pomocą enzymatycznej polimerazy DNA α. Tworzy ~ 10 podstawowych RNA i 20-30 zasad DNA (Lewin, 2004). Po rozpoczęciu łańcucha nukleotydowego starter RNA usuwa się, a lukę wypełnia polimeraza DNA I w prokariotach i polimeraza DNA β w eukariotach.

4. Polimerazy DNA:

Prokarionty mają trzy główne typy syntetyzujących DNA enzymów zwanych polimerazami DNA III, II i I. Wszystkie z nich dodają nukleotydy w kierunku 5 '-> 3' na odcinku 3 '-> 5' nici macierzystej. Mają także aktywność 3 '-> 5' egzo-nukleazy. Podczas gdy polimeraza DNA III głównie uczestniczy w replikacji DNA (dodawanie i polimeryzacja nowych zasad), polimeraza I jest głównym enzymem naprawczym. Polimeraza II jest niewielkim enzymem naprawczym.

Polimeraza DNA I ma także aktywność egzonukleazy 5 -> 3. W eukariotach znajduje się pięć typów polimerazy DNA - α, β, γ, δ i ε, ale główne trzy to α, δ i e. Polimeraza 8 bierze udział w replikacji wiodącej nici. Polimerazy mogą pomóc w syntezie opóźnionego pasma wraz z innymi rolami. Polimeraza α jest największym i głównym enzymem replikacji DNA. Wszystkie polimerazy DNA mają konfigurację chwytnej ręki z kciukiem po jednej stronie, palcami po drugiej i wklęsłą stroną katalityczną dłoni do łączenia par szablonowych i podstawowych.

5. Base Pairing:

Dwie oddzielone nici DNA w widelcu replikacyjnym działają jako szablony. Trójfosforany deoksyrybonukleozydów znajdują się naprzeciwko zasad azotowych eksponowanych szablonów DNA - deTTP przeciw A, deCTP przeciwnie G, deATP przeciw T i deGTP przeciwnie do C.

Atak nukleofilowy oddziela pirofosforan (PPi) od trifosforanu. Ustalono wiązania fosfodiestrowe. Hydroliza pirofosforanu przez enzym pirofosfatazę uwalnia energię. Trójfosforan deoksyrybunkowoosulfonowy → Monofosforan deoksyrybonukleozydu + PPi

Energia wykorzystywana jest do tworzenia wiązań wodorowych między wolnymi nukleotydami a podstawami azotowymi szablonów.

6. Formacja łańcuchowa:

Wymaga polimerazy DNA III (Kornberg, 1956) u organizmów prokariotycznych i polimerazy δ / e w eukariotach. Polimeraza DNA III jest złożonym enzymem mającym siedem podjednostek (a, β, ƍ, ƴ, €, θ, τ). W obecności Mg2 ⁺, ATP (GTP), TPP i polimerazy DNA III, sąsiednie nukleotydy znalezione przyłączone do zasad azotowych każdej matrycowej nici DNA tworzą wiązania fosfodiestrowe i łączą się z utworzoną replikowaną nicią DNA.

Wraz z postępem replikacji nowe obszary dupleksu DNA rodzicielskiego rozwijają się i oddzielają, tak że replikacja przebiega szybko z miejsca pochodzenia w kierunku drugiego końca. Primer RNA zostaje usunięty, a luka wypełniona komplementarnymi nukleotydami za pomocą polimerazy DNA I. Z powodu sekwencyjnego otwierania podwójnego łańcucha DNA i jego replikacji w celu utworzenia dwóch łańcuchów, replikacja DNA jest również nazywana duplikacją zippera.

Jednak polimeraza DNA może polimeryzować nukleotydy tylko w kierunku 5 '→ 3' na nici 3 '-> 5', ponieważ dodaje je na końcu 3 '. Ponieważ dwa łańcuchy DNA biegną w kierunkach przeciwrównoległych, dwa szablony zapewniają różne końce dla replikacji. Replikacja przez dwa szablony przebiega w przeciwnych kierunkach. Jedno pasmo o polarności У -> 5 'tworzy ciągłe pasmo, ponieważ koniec 3' jest zawsze otwarty dla wydłużenia.

Nazywa się wiodącą linią. Replikacja jest nieciągła na drugim szablonie o polarności 5 '→ 3, ponieważ tylko krótki odcinek nici DNA można zbudować w 5' → 3 kierunku ze względu na ekspozycję małego odcinka matrycy w tym samym czasie. Krótkie segmenty replikowanego DNA nazywane są fragmentami Okazaki (= segmenty Okasaki, Reiji Okazaki, 1968). Każda z nich ma 1000-2000 bp w organizmach prokariotycznych i 100-200 bp w eukariotach.

Primer RNA jest również wymagany za każdym razem, gdy ma zostać zbudowany nowy fragment Okazaki. Po zastąpieniu primera RNA deoksyrybonukleotydami i ich polimeryzacją, fragmenty Okazaki łączy się ze sobą za pomocą enzymu, ligazy DNA (Khorana, 1967). Nić DNA zbudowana z fragmentów Okazaki nazywa się pasmem opóźniającym.

Ponieważ jedna nić rośnie nieprzerwanie, podczas gdy druga nić powstaje w sposób nieciągły, replikacja DNA jest półciągła. Ponieważ replikacja przebiega dwukierunkowo od początku replikacji lub ori, jedna nić macierzysta utworzy wiodącą nić po jednej stronie i opóźnioną nić po drugiej stronie. Odwrotna sytuacja występuje na rodzicielskich łańcuchach drugiej strony. Pomaga to w zakończeniu replikacji jednocześnie w całym replikonie.

7. Dowód czytania i naprawa DNA:

Podczas replikacji czasami wprowadzana jest niewłaściwa baza. Częstotliwość wynosi jeden na dziesięć tysięcy. Polimeraza DNA III jest w stanie wyczuć to samo. Wraca, usuwa niewłaściwą bazę, umożliwia dodanie odpowiedniej bazy, a następnie kontynuuje. Jednak nawet polimeraza DNA III nie jest w stanie odróżnić uracylu od tyminy, tak że często jest on włączony zamiast tyminy. Takie niedopasowanie jest korygowane za pomocą pewnej liczby enzymów.

Istnieje oddzielny mechanizm naprawy wszelkich uszkodzeń DNA spowodowanych mutacją, promieniowaniem UV lub niedopasowaniem, które wymykają się mechanizmowi odczytu. Pseudonim lub przerwa spowodowana jest przez endonukleazę w pobliżu miejsca naprawy. Polimeraza I DNA (Komberg, 1969) usuwa niedopasowane lub błędne nukleotydy, o ile są obecne, i syntetyzuje prawidłową zamianę, stosując nienaruszoną nić jako matrycę. Nowo utworzony segment jest uszczelniony przez ligazę DNA.